慢慢的慢病毒
上一周我在介绍转座子系统的时候有说到慢病毒的坏话，但是说到敲减过表达，慢病毒必须要有排面。且慢病毒的受众广泛到甚至可以感染神经元等高度分化不再分裂的细胞。不知道大家有没有疑惑过，慢病毒为什么叫慢病毒，难道是因为它慢吗？答案是TRUE，想想HIV的潜伏期可高达十几年就可知它有多慢了。
就像WB和PCR一样，要是都没听过或者做过慢病毒，都不好意思说自己是做分子生物的。慢病毒将自己的基因整合到宿主中的行为是天性，而科学家们正是利用这个天性，使得慢病毒成为优质、高效且廉价的基因编辑工具。想想都不由的鸡皮疙瘩起来，从第一次工业革命到现在才短短几百年，人类社会进入了技术爆炸时代，不断有新的技术涌现而来，尽管如此，新技术也是旧技术思维的部分延续。因此，今天我们来谈谈慢病毒。
1. 慢病毒简介
慢病毒（lentivirus）属于逆转录病毒科下的慢病毒属，由于慢病毒感染宿主后，在经历较长的潜伏期后缓慢发病，因此被称为慢病毒。先来看一下慢病毒在逆转录病毒家族中的的定位：
Saxena S K, Chitti S V. Molecular Biology and Pathogenesis of Retroviruses[M]//Advances in Molecular Retrovirology. IntechOpen, 2016.
从图中我们可以获取以下几个信息：
（1）慢病毒属于逆转录病毒科，它的“同胞”还有α，β，γ，δ，ε逆转录病毒（都是按照希腊字母排序的），其中不乏几个熟面孔，例如：α中的肉瘤病毒，β中的乳腺肿瘤病毒，γ中的白血病病毒（被用于构建载体），δ中的人类T细胞淋巴病毒，ε中的表皮增生病毒。慢病毒并不是个例，它的“同胞”们也没有逃脱被用于科研研究的命运。
（2）可以看到慢病毒在几个典型物种中都是免疫缺陷病毒，例如在人类上大名鼎鼎的HIV病毒。
2. HIV病毒
目前在分子克隆领域中我们主要接触的慢病毒载体系统就是从人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency viruses，HIV）改造而来的。HIV病毒分为1型和2型，其中1型是造成人类AIDs的主要原因（HIV病毒仍然有非常详细的亚分类），下面我们以1型为例介绍慢病毒的生命结构。
image.png
从上图HIV-1的基因结构和病毒示意图我们可以了解到：
（1）HIV-1是拥有二倍体RNA基因组（9.7 kb）的包膜病毒，可以看到图中有两条RNA；
（2）HIV-1用有9个功能基因：3个结构基因（gag, pol, env）， 2个调节基因（tat, rev）和4个辅助基因（vif, vpu, vpr, nef）。除此之外，还要注意两侧的LTR序列，tat需要与LTR序列结合才可以调控基因的转录；
（3）HIV-1入侵人体T细胞过程：Env与CD4+ T淋巴细胞表面的CD4受体、CCR5/CXCR4共受体结合；之后Env构象改变并暴露gp41亚基上的融合肽，该融合肽介导膜融合并诱导病毒核心进入；病毒核心一旦进入细胞，就会脱去外壳并释放出遗传物质ssRNA；在Pol编码的逆转录酶帮助下逆转录成DNA并整合到宿主基因组中。之后就是借鸡生蛋的故事了。
addgene-lentivirus guide
3. 慢病毒载体系统
关于慢病毒载体系统，目前有4代慢病毒系统。了解慢病毒系统的组成和分类，对我们选择慢病毒工具具有指导意义。
Canadian Biosafety Guideline - Lentiviral Vectors
通过上图可以看到，慢病毒载体系统一般会包含有：
（1）Transfer/Vertor plasmid：包含我们想要转入的目的基因序列。
转基因序列的两侧是长末端重复（LTR）序列，在病毒转导过程中整合到宿主基因组的是LTRs之间的序列，包括LTRs。基于HIV-1病毒的慢病毒基因转移质粒，出于安全考虑，转移质粒都不能自我复制，并且三代包装质粒在3'LTR中包含一个额外的缺失，使病毒在整合后自我灭活（self-inactivating，SIN）。
（2）Packaging plasmid(s)：形成核心蛋白
（3）Envelope plasmid：形成包膜糖蛋白
3.1 一代慢病毒系统
这里的慢病毒分类主要依据上图来划分，比较方便介绍。实际上文章中还指出第一代慢病毒系统是两质粒系统：由于产生病毒的滴度低，且只能感染CD4 +细胞，在转染过程中包装的蛋白DNA和载体DNA有重组的可能，进而产生有产生有复制能力病毒且可能有HIV活性的病毒，风险程度大。
这里我们说的病毒第一代慢病毒载体系统是由HIV衍生的三质粒系统：
（1）包含Ψ启动子（LTRΨ）的基因转移质粒
（2）包装质粒
（3）包膜制粒，为了增加慢病毒载体系统的趋向性，包膜质粒中的env基因可被异源糖蛋白基因取代。当env基因被水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G）基因取代后，慢病毒的宿主范围得以扩大。
3.2 二代慢病毒系统
为了进一步提高慢病毒载体系统的安全水平，控制HIV致病能力的辅助基因nef、vif、vpu及vpr被从包装质粒上移除，从而减少重组事件的发生。
3.3 三代慢病毒系统
第三代系统在几个关键方面进一步改进了第二代系统的安全性：
（1）将5' LTR修饰为带有外源启动子的嵌合5' LTR，该启动子不再依赖于tat激活，由于不再需要tat，所以tat也被从包装质粒中移除，但tat的移除也会降低病毒的滴度；
（2）将剩余的HIV包装基因分离为两个包装质粒：一个带有gag和pol，另一个带有rev。虽然更安全，但由于添加了一个额外的质粒导致病毒滴度更低且使用更麻烦。
（3）一些第三代系统转移质粒的3' LTR存在缺失，在逆转录过程中被转录到5' LTR，从而影响启动子活性，最后达到自我灭活的效果。这种修饰解决了生物安全问题：转移和辅助质粒之间的重组，由LTRs引起的肿瘤形成。
需要注意：第三代转移质粒可使用第二代包装系统，但第二代转移质粒不能用于第三代包装系统。
3.4 四代慢病毒系统：举例介绍
经过上面的介绍我们了解到，慢病毒工具从创始之处到现在，尽管针对其生物安全性的考量，已经做了大量的改造，但其生物安全性仍然是一个非常重要的问题，针对生物安全性的改造仍然是慢病毒系统进化的方向。目前已有商用的四代慢病毒载体系统，例如TAKARA的Lenti-X fourth-generation packaging systems：
image.png
可以看到：
（1）该四代慢病毒包装系统是5质粒系统；
（2）用于增强病毒转录和感染力的Vpr被引入回来，使得高滴度高感染力的病毒可以产生；
（3）tet-off系统的引入和Tat基因的回引，增加病毒产量；
（4）将三代系统中的gap-pro-pol质粒进一步分开为两个质粒，这样具有复制能力的病毒需要三次重组才能生成，减少了RCR（具有自我复制能力的慢病毒）时间的发生，更为安全。
综上所述，可见增加慢病毒安全性的目的是：降低具有自我复制能力的慢病毒。主要手段在于：去除辅助蛋白基因，灭活LTR启动子，拆开核心蛋白使得有效重组频率降低等等。
4. 慢病毒包装
简单说一下慢病毒包装的流程：
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高滴度的慢病毒包装依赖于高效率的质粒转染和适合的生产宿主。因此为了包装出滴度更高的慢病毒：
（1）挑选合适的工具细胞：293T或者293FT，具体可参照之前的293细胞家族介绍文章，此外工具细胞的健康状况要足够好。HEK293：我还是那个搬砖少年，没有一丝丝改变。
目前我们实验室的是293FT细胞，该细胞在低密度是生长速度缓慢，当达到百分之40融合度之后可以一夜长满，虽然两三天不换液看起来没事，但其实细胞个头在慢慢变小，伪足也变得细瘦。293FT细胞特别怕冷又怕冲撞，培养基不够温热会使它蜷缩，加培养基滴到都会被滴出一个洞，因此即使293具有强大的繁殖能力也禁不住饥寒交迫的折磨，请一定要让它们好吃好喝，吃饱穿暖。此外，293细胞最好使用更为早期的代数，除了随着代数增加，细胞可能老化的原因之外，不要忘了293细胞的p53蛋白已经被SV40大T抗原裹挟，传代次数的增加会引入随机突变，这些随机突变指不定会对细胞状态以及其生产能力造成影响。
（2）使用高效率的质粒转染试剂：我在之前的文章中推荐使用罗氏公司的X-treme HP reagent，主要原因是效率高，使用方便又大碗。但最近我变卦了，对于CRISPR screening这样需要大批量包装病毒的实验来说，一次就能用到半支lipo 3000，再有钱的实验室也禁不起这样玩，此时PEI的身影映入眼帘。PEI 20, 000的效果足以和X-treme媲美，而PEI 40, 000（PEI 40k）效率更高，且1 g PEI 40k粉末可以配1 L，现在马上去买它！（请斟酌后再决定）
（3）合适的细胞密度。
（4）良好的质粒比例：需要根据使用的包装系统不同来调整，这是一个对病毒滴度影响比较大的point。
（5）适合的收样时间点：需要注意慢病毒在常温下尚且不稳定，更何况是在37℃的培养箱，在48 h收取或者24、48 h分别收取后合并。
（6）滴度不够怎么办？
高速离心或者加入PEG8000后4000 g，4度离心20 min。
关于慢病毒包装方面，相信大家一定有很多很多自己的Tips，鉴于目前我的慢病毒包装经验较少，这里就不放protocol，我在写这篇文章的时候参考了一些综述、addgene上的poster、政府生物安全指南以及吴思涵的知乎文章。关于慢病毒包装的protocol，相信大家可以随便一个地方就能找到非常完整的教程。因此这里我仅仅作为一个知识的搬运工，整理一些资料并表述一些个人的想法，达到知己知彼的效果，并希望也能小小的帮助到别人。
