实用干货|单细胞测序样本冻存及复苏指南
制备好的单细胞悬液，如因实验时间或实验条件所限，不能立即进行单细胞测序实验，可选择将细胞样本进行冷冻保存。待需要实验时，再对冻存细胞样本进行复苏，并进行后续的单细胞测序实验。
一、细胞冻存及注意事项
1. 细胞冻存步骤
a. 取出冻存管，注明细胞名称，代数，日期。
b. 离心后，以无菌吸管吸弃上清，不要吸到底部的细胞沉淀。
c. 将细胞沉淀与冻存液充分混匀，根据计数结果，将细胞总数调节成细胞数量为105/ml为宜。
d. 将细胞冻存悬液分装进细胞冻存管中，一般2ml的冻存管中装入1-1.5ml冻存液为宜。
e. 严密封口后，使用可控制降温速度的冷冻装置冷冻细胞，使温度每分钟大约降低 1℃。或者，将装有细胞的冻存管放入异丙醇冻存盒中，然后将冻存盒置于–80℃条件下过夜。
f. 第二天将已经冷冻的细胞转移到液氮容器中，置于液氮上方的气相空间中储存。
2. 冻存注意事项
a. 冻存细胞样本以备将来之用时，建议遵守以下原则，以便获得最佳结果。
b. 在高细胞浓度情况下进行培养细胞的冻存，并且细胞传代次数尽可能少。确保冻存前活细胞百分比至少为 90%。请注意最佳冻存条件取决于所用细胞系。
c. 细胞应缓慢冷冻，可使用可控制降温速度的低温冰箱或者低温冷冻容器，使温度每分钟大约降低 1°C。
d. 必须使用推荐的冻存培养基。冻存培养基中应含有 DMSO 或者甘油等冷冻保护剂。冷冻保护剂可降低培养基的冰点，并可减缓冷却速度，大大降低冰晶形成的危险 (冰晶可损伤细胞，导致细胞死亡)。注：DMSO可促进有机分子进入组织。操作含 DMSO 的试剂时，应采用与此类物质安全危害相适应的设备和操作规范，并应按照当地法规处置此类试剂。
e. 注意冷冻保护剂之品质：DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5-10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。
f. 将冷冻的细胞于–70℃以下温度储存；温度高于–50℃时，冷冻的细胞将开始变质。
g. 必须使用无菌冻存管储存冷冻的细胞。装有冷冻细胞的冻存管可浸于液氮或者在液氮上方的气相空间内保存。生物危害性物质必须储存在液氮上方的气相空间内。将密封的冻存管置于气相空间储存可避免冻存管发生爆炸。如果使用液氮进行储存，必须注意玻璃和塑料冻存管有发生爆炸的危险，应佩戴面罩或护目镜。
h. 所有与细胞接触的溶液和设备均应为无菌状态。采用正确的无菌技术，并且在层流通风橱内进行。
i. 细胞慢冻的原则：缓慢冻存，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，结晶就大，大结晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。
二、细胞复苏及注意事项
1. 细胞复苏步骤
a. 从液氮或干冰中取出冻存管，核对冻存管壁的样本信息及冻存日期准确无误。稍稍拧松冻存管盖，以确保若冻存管内还残留少量液氮，使其完全挥发，避免受热炸裂。
b. 在37℃温水浴中加热冻存管，并轻轻晃动以加速解冻过程，直至冻存管内的冻存保护完全融化（确保整个过程在1-2min以内完成）。
c. 从水浴中取出冻存管，用酒精棉对冻存管口及外表面进行消毒。
d. 将细胞样本连同冻存液一起转移至新的15mL离心管，加入5mL事先预热的细胞完全培养基，轻柔吸打将液体混合均匀。
e. 室温离心300×g，5min，吸去上清，不要扰动离心管底部的细胞沉淀。
f. 加入合适的溶液，轻柔重悬细胞样本，用于后续生物实验。
2. 复苏注意事项
a. 如条件允许，建议可将同一次实验样本分多管冻存，以保证实验成功率。
b. 组织冷冻保存液中会含有DMSO等有毒性的有机试剂，操作时请务必带佩戴实验用手套、口罩，并避免皮肤、呼吸消化道以及眼睛直接接触试剂。
c. 对生物样本进行冻存复苏过程中，会频繁使用液氮。请佩戴护目镜等安全保护措施，并避免液氮飞溅泼洒，以免烫伤。
三、细胞冻存复苏实验结果
百奥医药在单细胞测序相关实验方面具有丰富的经验，成功完成过大量细胞样本冻存及复苏实验。以下对3个人PBMC样本的冻存及复苏实验结果进行展示。3个细胞样本冻存前，细胞活性均在90%以上，分别于30天、60天、90天复苏，复苏后细胞活性均达到了80%以上，基本满足后续单细胞测序建库要求。
1. 细胞样本冻存前质检结果
A细胞样本冻存前质检结果
B细胞样本冻存前质检结果
C细胞样本冻存前质检结果
2. 细胞样本复苏后质检结果
A细胞样本冻存30天后复苏质检结果
B细胞样本冻存60天后复苏质检结果
C细胞样本冻存90天后复苏质检结果
王俊杰 | 文案
