数字PCR（一）— 基础介绍

数字PCR是一种核酸检测和绝对定量的新方法。同传统PCR以及qPCR相比，数字PCR增加了一步分液(partitioning)的操作，将几十微升的已经配好的包含有引物、模板、buffer、酶等组分的PCR反应体系分隔成了众多微小的、独立的反应体系

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在分配的过程中，引物、酶等组分过量，而模板则是不过量的。模板DNA分子随机地进入到各个小的反应体系中，经过PCR扩增后，包含模板的体系完成扩增，不包含模板的体系无扩增。模板DNA分子进入各个小的反应体系的过程满足泊松分布规律，因此，检测扩增PCR产物的信号强度，带入泊松分布计算，即可计算出起始模板DNA分子的拷贝数

目前数字PCR有两种分配技术：

芯片式：

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油包水液滴式

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值得注意的是，在DNA模板被分配的过程中，DNA模板分子数和分配系统的能力有密切的关系。假设DNA模板是 2000 copy，要被分配到1000个小的反应体系中。那么会出现如下的情况：
即每个小反应体系中，DNA模板不同，经40轮PCR扩增后，凡是包含模板的小反应体系PCR扩增均能进入平台期。因此，对于dPCR反应来说，模板起始分子数与分配系统个数存在密切关系，不能过饱和。在不饱和的情况下，无模板的无扩增的反应体系个数带入泊松分布公式计算，推出起始DNA模板分子数。

数字PCR发展

国外

• QuantaLife 利用油包水微滴生成技术 开发了微滴式数字PCR技术，这也是最早出现的相对成熟的数字PCR平台，在运行成本和实验结果稳定性方面都基本达到了商品化的标准。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪继续在市场上销售，这个早期型号为dPCR概念的普及和应用领域的拓展发挥了重要作用。2013年该公司又推出了升级型号QX200。可将20ul反应体系采用液滴反应器形成20000个油包水反应体系，PCR反应结束后，通过检测每一个微液滴，统计阳性反应的液滴数量。

• 2012年，RainDance公司推出Raindrop型号数字PCR设备，这个设备将其原有的二代测序文库制备平台技术平移到数字PCR技术平台，在高压气体驱动下，将每个标准反应体系分割成包含100万至1000万个皮升级别微滴的反应乳液， 该公司的创始人之一Darren Link表示这种超高的微滴数目可以为用户“提供更高的检测动态范围，适用于处理更大浓度差异的不同样品” 。其原理与伯乐微滴数字PCR相同，但是其液体形成能力比伯乐强很多，理论上可以产生1000万个小油滴。

• 2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统， 这也是目前数字PCR市场上最新型号的产品。采用高密度的纳升流控芯片技术，样本均匀分配至20,000个单独的反应孔中。在整个工作流程中，样本之间保持完全隔离 ，可以有效地防止样品交叉污染，减少移液过程，简化操作步骤。同时芯片式设计避免了微滴式系统可能面临的管路堵塞问题。可将将20ul反应体系分散到20000个微孔中进行反应，变成20000个反应体系，PCR反应结束后，采用CCD拍照，数阳性反应孔。

国内

• 数字PCR曾在2013年被《麻省理工大学科技评论》评为十大突破技术之一，2017年入选《世界经济论坛》评出的全球十大新兴技术，经过几年的发展，目前在国内的临床分子检测已经小规模得以运用。
• 2015年，国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会，在广泛征求意见的基础上，制订了《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》，在此次《肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）》中，以QX200为技术代表的数字PCR技术，已经正式写入进去。
• 2016年4月，科维思在Thermo Fisher产品的基础上，申请了核心耗材的发明专利，并申请了IVD类医疗器械审批的绿色通道：芯片式数字聚合酶链式反应（DPCR）分析系统。
• 2017年7月27日，CFDA天津市市场和监督管理委员会已正式批准天津诺禾致源生物信息科技有限公司的数字PCR芯片阅读仪——Digital PCR NG上市[ 津械注准 20172400198 ]（与Thermo Fisher合作开发），同时，明确该仪器适用于来源于人体的血浆游离DNA样本中的T790M突变进行检测。标志着该仪器成为国内首个获食药监局批准上市的数字PCR芯片阅读仪。（CFDA可查）
• 2017年10月，顺德永诺成功研发微滴式数字PCR仪MiniDrop™，系我国首款拥有完全自主知识产权的微滴式数字PCR仪，并投入生产。
• 2017年10月31日，CFDA重庆市食品药品监督管理局正式批准重庆泛生子生物科技有限公司的生物芯片阅读仪（Digital PCR）——GENETRON 3D上市[ 渝械注准20172400136 ]（与Thermo Fisher合作开发）。

参考
1.基因Talks公众号：分子检测丨dPCR检测技术介绍
2.http://www.jnruimo.com/jishuzho/50