CRSPER- dCas9在转录调控与表观遗传中的应用

原创： 赛诚生物 赛诚生物 2018-01-26

Cas9的核酸酶发生双突变产生“钝化”和“死亡”Cas9，即“dCas9”，这种核酸酶失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。dCas9蛋白可以与效应器阻遏（如蛋白和激活剂结构域）形成融合蛋白，这样，dCas9可以将这些效应器带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤。可用于研究转录因子或辅助转录因子对特定基因的影响。

CRISPR dCas9—转录调控系统

Figure1

Figure1 – dCas9 as a modular system for attachment of transcriptional regulators.dCas9 can easily be fused to effectors (either transcription activators orrepressors) for targeted gene regulation. Adapted from Figure 1a of Gilbert etal. (2013).

dCas9系统调节基因的激活或抑制

dCas9-SAM—CRISPR Cas9基因激活系统

在第一代dCas9-SAM系统中，dCas9与典型的转录激活因子如VP64（单纯性疱疹病毒蛋白16的合成四聚体）或p65（参与许多细胞过程的转录因子）融合。这个系统可以在多种真核细胞的全基因组范围内进行基因激活，但只有中等程度的激活（2-5倍）。

为了增强激活能力，开发了二代dCas9-SAM系统。该系统建立在基本的dCas9-VP64结构上，但其中的sgRNA是经修饰过的，可以募集额外的转录激活因子以达成协同激活作用。这种修饰的sgRNA包含了两段可结合噬菌体MS2外壳蛋白二聚体的发卡结构。 MS2蛋白与另外的活化剂如p65和人热休克因子1（HSF1）融合，这使得每个dCas9分子可以募集13个活化分子。

这个新的dCas9-SAM系统可以可靠地将基因表达从10倍增加到几千倍。由于这个系统需要设计修饰的sgRNA，人们开发了第三代dCas9-SAM系统，也称为dCas9-VPR系统。这个系统由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，这大大简化了设计过程。当与sgRNA文库结合使用时，该系统还能够支持大规模的全基因组功能激活，使其成为研究生物学过程和途径的有力工具。

dCas9-SAM系统是一种，在不改变内源基因组的条件下，可以选择性地上调特定靶基因表达的简便方法。由于其强大的激活能力，该系统将成为跨越多种细胞类型的治疗性干预、基因筛选工具。研究人员已经开始利用dCas9-SAM系统激活HIV-1转录，诱导细胞凋亡以及诱导休HIV-1前病毒休眠。

Figure2

Figure2 – The dCas9-SAM transcriptional activation system. a) The dCas9-SAM system ismade up of a dCas9 fused to the transcriptional activator, VP64. Theaccompanying sgRNA can also be modified to contain two RNA aptamers for bindingwith MS2 coat proteins that are also fused to one p65 and one HSF1transcription activator. Adapted from Figure 1f of La Russa et al. (2015). b) Acomparison of the activation efficiency of dCas9-VP64 by itself (yellow) aswell as with the modified sgRNA system (green) in the activation of fourdifferent genes: HBG1, IL-1B, IL1R2, and ZFP42. Relative expression levels werequantified using qPCR, with fold changes determined by comparing with GFP-transfectedcells. Adapted from Figure 1b of Konermann et al. (2015). c) The dCas9-VPRsystem is composed of an ordered fusion of transcriptional activators VP64,p16, and RTA. This system does not require a specially modified sgRNA toachieve the same activation capability as the dCas9-SAM system. Adapted fromFigure 1a of Chavez et al. (2016). d) A comparison of the activationperformance of dCas9-VP64, dCas9-VPR, and dCas9-SAM of the RHOXF2 gene

dCas9-KRAB—CRISPRCas9基因抑制系统

单独的dCas9与靶位点的结合在空间上可以干扰转录酶的结合，起到抑制靶向基因转录的作用，这一过程称为CRISPRi（或CRISPR干扰）。这个简单的CRISPRi系统可以高达1000倍抑制，有效敲低细胞中的基因表达。虽然这个系统在细菌，酵母和其他原核细胞中的表现相当好，但它在抑制哺乳动物细胞中的基因表达方面效果较差。

因此我们开发了dCas9-KRAB系统，在这个系统中，dCas9与Kox1的转录阻遏物结构域KRAB（Krüppel-associated box）融合。这种增强的CRISPRi系统依靠KRAB募集各种各样的组蛋白修饰因子，通过形成异染色质的方式可逆地抑制基因表达。

该系统，在瞬时转染期间可以高度特异性地使内源性真核基因表达降低60-80％。此外，在HeLa细胞中，稳定整合到基因启动子区域的dCas9-KRAB可以使内源性基因产生5-10倍的抑制作用，当靶位点位于转录起始位点下游50-100bp时可产生100倍的抑制效应。 dCas9-KRAB对细胞生长没有影响，使其成为无毒的基因沉默方法。

不同于其他经典的基因沉默方法，如RNAi（一种通过降解细胞质中mRNA来敲低基因表达的方法），dCas9-KRAB系统在DNA水平上提供可抑制。这使得高度特异性抑制非编码RNA，miRNA，反义转录物和核定位的RNA成为可能。

Figure3

Figure 3 – The dCas9-KRAB transcriptionalrepression system. a) dCas9 can be fused to KRAB, a transcriptional repressor.Adapted from Shalem et al. (2015). b) A comparison of relative CD71 expressionlevels in a dCas9 (blue) vs. a dCas9-KRAB (red) system targeted to CD71 usingthree different sgRNAs. Relative expression levels were determined from flowcytometry for CD71 protein expression. Adapted from Figure 3c of G****ilbert et al. (2013).

引言
表观遗传调节是往往是通过影响一段染色质的结构起作用，比如将染色质压缩成紧密状态（异染色质），使基因难以转录，或者使染色质打开以促进转录。表观遗传调节包括DNA甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、组蛋白磷酸化等等。

最近，人们将dCas9与表观遗传修饰酶融合在一起，形成dCas9表观遗传编辑系统，该系统成员如表1所示。

Table 1

Table 1 - The dCas9Epigenetics Toolbox

dcas9-组蛋白修饰

dCas9-p300表观遗传激活系统（组蛋白乙酰化系统）
组蛋白乙酰化是最强大的基因表达增强子系统之一。dCas9-p300的开发，使得人们能够直接改变靶标基因附近的染色质状态。在这个系统中，人类E1A相关蛋白p300的催化核心与dCas9融合，这是组蛋白乙酰化的关键成分。

当靶向编码区或启动子区时，这个系统可成功诱导基因高表达。特别是，当靶向启动子或增强子时，基因表达可增强50至10,000倍。通过转录组分析评估得到，基因激活是高度特异性的。这表明该系统可以精确调控某段染色质的变化。

dCas9-p300是一种简单而独特的工具，可用于研究调控元件和靶基因表达之间的复杂关
系。

Figure 4

Figure 4 – ThedCas9-p300 system for epigenetic activation. a) dCas9 fused to the corecatalytic domain of p300 can acetylate target sites in the genome. Acetylationof the target gene synergizes with the action of transcription factors and RNAPolymerase II, resulting in transcriptional upregulation. Adapted from Figure 1bof Zentner et al. (2015). b) Comparison of relative expression levels of IL1RNwhen dCas9 by itself vs. dCas9 fused to the p300 catalytic core is targeted tothe IL1RN promoter. Relative expression levels determined by qRT-PCR. Adaptedfrom Figure 1c of Hilton et al. (2015).

dCas9-LSD1表观遗传抑制系统（组蛋白去甲基化系统）

dCas9-LSD1是dCas9-p300激活系统的互补基因抑制系统。在该系统中，dCas9与赖氨酸特异性组蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合（图5a）。 Kearns等人在稳定表达dCas9-LSD1的小鼠胚胎干细胞系中，设计Oct4基因的远端增强子区域的gRNA，Oct4基因被抑制。

然而，当dCas9-LSD1针对Oct4启动子时，没有观察到效果。这使得dCas9-LSD1成为研究增强子调控活性的工具。这与其他系统如dCas9-KRAB（它们是更全面的基因表达控制器）互补。当靶向上游增强子时，dCas9-LSD1也能够使下游基因表达沉默（图5b），而不破坏基因组结构。

由于在增强子区域内发现了与人类疾病相关的许多基因组区域，因此dCas9-LSD1以高度特异的方式功能性地靶向增强子元件的能力使其在定义增强子 - 基因关系方面具有无价之宝。当与增强子靶向的sgRNA池组合使用时，该系统可以提供高通量的方式来鉴定与基因相关的所有增强子。

Figure 5

Figure 5 – ThedCas9-LSD1 system for epigenetic repression. a) dCas9 fused to LSD1 candemethylate target sites in the genome. Demethylation of the target generesults in transcriptional downregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner etal. (2015). b) The relative expression level of the TBX3 gene was assessed viaquantitative PCR analysis when the sgRNA of the dCas9-LSD1 system was fusedwith a distal enhancer vs. a promoter. sgRNAs specific to an unrelated genomicregion were used as controls. Adapted from Figure 1e of Kearns et al. (2015).

dCas9-DNA甲基化修饰

dCas9-Tet1-CD –dCas9-DNA去甲基化修饰系统
哺乳动物细胞中的靶向DNA甲基化主要发生在CpG二核苷酸序列内胞嘧啶的第五个碳上。细胞发育，分化和肿瘤都可以通过DNA甲基化来调节，高甲基化与癌症和神经系统疾病密切相关。使DNA甲基化易于调节的技术可以直接探索甲基化状态和基因表达之间的功能关系，甚至可以开发治疗疾病的疗法。

dCas9-Tet1-CD是以这种方式编辑表观基因组的新技术之一。该系统由与Tet1（十 - 十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶1）的催化结构域融合dCas9组成，该酶触发DNA去甲基化（图6a）。伴随的sgRNA也可以进行修饰，使之包含一个MS2二聚体，每个二聚体再与两个Tet1-CD模块融合。

有研究表明，该系统转染后4天后观察到基因的激活（图6b）。在不同的人和小鼠细胞系中，结合精确的sgRNA设计和控制该系统不同组分的比例，dCas9-Tet1-CD系统及其伴随的MS2-Tet1-CD系统能够在特定位置有效去甲基化，且具有很小的脱靶效应。

dCas9-Tet1-CD系统地靶向特异性将帮助科学家轻易地探索特定基因启动子靶点甲基化对下游基因的影响。最近，dCas9-Tet1-CD系统结合常规sgRNA也被用于靶向BRCA1启动子的表观遗传修饰，BRCA1是一种肿瘤抑制基因，其过度甲基化沉默与非家族性乳腺癌和卵巢癌相关[15] 。这样的系统也可以用来恢复其他肿瘤抑制基因的功能活性。

Figure 6

Figure 6 – ThedCas9-TET1-CD system for targeted DNA demethylation. a) dCas9 is fused to thecatalytic domain of TET1 (TET1-CD). The accompanying sgRNA is additionallymodified to contain two RNA aptamers that recruit MS2 coat proteins, each fusedto a TET1-CD. Adapted from Figure 1a of Xu et al. (2016). b) qRT-PCR was usedto assess mRNA levels of RANKL gene expression using two sgRNAs designed totarget the RANKL promoter region (-800 bp upstream of transcription startsite). Adapted from Figure 2c of Xu et al. (2016).

dCas9-DNMT3A —dCas9-DNA甲基化修饰系统

与基于组蛋白的细胞表型控制不同，DNA甲基化对基因表达的作用更稳定和长期。基于dCas9的甲基化系统不仅具有跨物种能力，而且对CpG甲基化不敏感。
dCas9-DNMT3A是先前讨论的dCas9-Tet1-CD系统的甲基化对应物。由Vojta等开发，该系统是dCas9（通过灵活的Gly4Ser接头）与DNMT3A的催化结构域（一种能够在体内甲基化CpG位点的活性DNA甲基转移酶）融合。这个dCas9-DNMT3A系统在HEK293细胞中成功地诱导BACH2启动子上游和下游的位点特异性CpG甲基化，最高浓度的甲基化活性（60％）位于PAM序列下游27bp处。当针对IL6ST启动子时，转染后10天后两种基因的表达水平均显着降低。
此外，通过dCas9-DNMT3A与sgRNA池结合同时靶向多个基因特异性位点导致甲基化的协同作用，将甲基化提高2倍，扩大该系统的基因沉默能力。
自其发展以来，dCas9-DMNT3A也被用于多种癌症相关的肿瘤抑制基因的启动子的甲基化如（CDKN1A和2A启动子甲基化）。该项研究表明，CDKN1A启动子的甲基化导致CDKN1A的表达下降和细胞增殖能力的增加，进一步证明了该系统用于功能基因组学研究。

Figure 7

Figure 7 – ThedCas9-DNMT3A system for targeted DNA methylation. a) dCas9 is fused to thecatalytic domain of DNMT3A. In vivo, DNMT3A recruits a partner for dimerizationalong with DNMT3L proteins (shown in dashed red box and ovals, respectively).Adapted from Figure 1a of Vojta et al. (2016). b) RT-qPCR analysis of IL6STgene expression via dCas9-fused to active DMNT3A. Expression levels induced bydCas9 fused to inactive DMNT3A along with dCas9 accompanied by non-targetingsgRNAs were measured as negative controls. Fold change is relative tomock-transfected cells. Adapted from Figure 4a of Vojta et al. (2016).