5.6分非肿瘤生信，单细胞+bulk分析筛选巨噬细胞相关基因，接

影响因子：5.6

研究概述：

急性肾损伤（AKI）是一种复杂的疾病，巨噬细胞在其进展中起着至关重要的作用。然而，巨噬细胞功能的机制仍然不清楚，针对AKI巨噬细胞的策略存在争议。作者使用单细胞RNA-seq分析来识别参与缺血再灌注诱导AKI的巨噬细胞亚型，然后使用交叉的bulk RNA-seq数据筛选相关枢纽基因，调查细胞分化的进展并用CellChat分析揭示细胞集群之间的串扰。作者预制了免疫荧光和RT-PCR，以验证已识别的枢纽基因的表达。在正常样本和缺血再灌注肾损伤（IRI）后3天之间的浸润巨噬细胞中发现了四个枢纽基因，Vim、S100a6、Ier3和Ccr1，都与IRI诱导的AKI进展有关。在IRI条件下，浸润的巨噬细胞中Vim、S100a6、Ier3和Ccr1的表达增加可能与炎症反应有关，并可能介导巨噬细胞和肾小管上皮细胞之间的串扰。结果显示，Ier3可能在AKI中至关重要，Vim、S100a6、Ier3和Ccr1可能成为IRI诱导的AKI的新生物标志物和潜在治疗靶点。

研究结果：

一、IRI诱导AKI中巨噬细胞单细胞转录组的研究

如图 1A 所示，1,261 个细胞被分为五个簇（簇 0-4）。生成每个簇的标记基因的热图（图1B）。对 M1 和 M2 巨噬细胞的亚型标记进行了比较。作为M1标记的Cd68、Il1b、Tnf和Cxcl10主要在簇0和4中表达，而其他标记物如Mrc1、Tgfb1、Cd163和Chil3主要在簇1中表达（图1C）。在 IRI 后第 0 天和第 3 天分析了 8,931 个肾脏驻留巨噬细胞。使用UMAP分析在二维空间中可视化细胞，作者发现了11个簇（簇0-10）代表不同的巨噬细胞亚簇（图1D-E）。M1 和 M2 巨噬细胞的数量在 IRI 后 3 天急剧增加（图 1F）。基于巨噬细胞假本体转录本，对正常组和3 dIRI组进行鉴别分析。IRI 后 3 天在巨噬细胞中鉴定出 1,032 个上调基因和 54 个下调基因（图 2A）。AKI 巨噬细胞组鉴定出 40 个上调基因和 37 个下调基因（图 2B）。

二、GSE121410巨噬细胞中的DEGs

使用 IRI 诱导的 AKI 第 3 天的巨噬细胞的 RNA-seq 信息进行 DEG 分析，在第 0 天和第 3 天，IRI 诱导的 AKI 巨噬细胞样本之间共过滤了 954 个 DEG，包括 867 个上调基因和 87 个下调基因（图 3A）。对这些上调基因进行了GO和KEGG分析，发现DEGs在“ECM受体相互作用”、“黏着斑”、“癌症中的蛋白聚糖”、“阿米巴病”和“PI3K-Akt信号通路”中富集（图3B）。对DEGs进行了交叉分析，鉴定出4个枢纽基因Vim、S100a6、Ier3和Ccr1（图3C）。

三、Vim、S100a6、Ier3和Ccr1与IRI诱导的AKI的进展相关

使用GSE180420和GSE174324数据集验证了Vim、S100a6、Ier3和Ccr1的表达水平。在GSE180420中，Vim，S100a6，Ier3和Ccr1在IRI后第3天在巨噬细胞亚簇的0，1和4中高表达（图4A，B）。在GSE174324中，这些基因在IRI后3天的簇0，1和6中高表达（图4C，D）。在GSE180420和GSE174324数据集的正常条件下，这四个基因在小鼠肾脏中的巨噬细胞中几乎没有表达。GSE 180420数据集在IRI后0天和3天对巨噬细胞进行细胞轨迹分化的模拟分析。巨噬细胞比例逐渐下降（图5A）。Vim，S100a6，Ier3和Ccr1的表达（特别是在3天IRI组）随着细胞分化的进展而增加（图5B-C，图5D-F). 热图显示了GSE180420（图6A）和GSE174324（图6B）中细胞转换相关基因的动态表达变化。在假拟时间AKI进展过程中，炎症生物学过程，包括白细胞趋化、炎症反应的正向调节和细胞对白细胞介素-1的反应均上调。

四、Ccr1在巨噬细胞中的表达介导巨噬细胞与肾小管细胞的相互作用

对巨噬细胞和肾小管细胞进行CellChat分析，包括远曲小管细胞（DCT）、主细胞（PC）、亨利氏环（LOH）、闰细胞（IC）和近曲小管细胞（PT）。在GSE180420数据集。图7A显示，在正常情况下，巨噬细胞与肾小管细胞的信号联系较弱，而在IRI后3天，巨噬细胞向远端肾小管细胞（如LOH、IC和PC）传递强信号（或从其接收强信号）（图7B）。配体-受体信号分析显示，IRI后3天，几种分泌信号和ECM-受体信号通路，包括细胞因子和趋化因子信号，介导了巨噬细胞和肾小管细胞之间的信息交流（图7C-D）。Ccr1轴是最显着的信号通路之一（图7C），表明巨噬细胞中的Ccr1可能介导浸润的巨噬细胞和肾小管细胞之间的相互作用。

五、通路在高表达Vim、S100a6、Ier3和Ccr1的巨噬细胞亚群中的富集

GSE174324中Vim、S100a6、Ier3和Ccr1的表达分析表明，它们主要表达于巨噬细胞簇0和1（图8A所示）GO生物学过程和KEGG相关基因上调的Vim表达簇0细胞进行了评估。结果显示，与“白细胞趋化”、“细胞因子和细胞因子受体”以及“抗原处理和呈递”相关的基因富集途径的普遍存在（图8B-C). 而在S100a6、Ier3和Ccr 1表达的巨噬细胞簇1通路中富集的“NFkappa B信号通路”、“趋化因子信号通路”、“细胞因子产生的正调节”和“白细胞趋化性”明显增强，氧化磷酸化和ATP代谢过程减少(图8D-E)。

六、Vim、S100a6、Ier3和Ccr1表达的验证

在H/R下，Vim、S100a6、Ier3和Ccr1在原代巨噬细胞中显著上调（图9A）。Vim和Ier3在复氧4小时后表现出最高的表达，并随着时间的推移逐渐降低。Ccr1在复氧8小时后达到峰值，S100a6在12小时达到峰值。初级巨噬细胞的免疫荧光染色分析显示了类似的结果（图9B）。免疫荧光证实，在这些小鼠的肾脏中，F4/80和S100a6双染细胞以及F4/80和Ier3双染细胞的数量增加（图10A）。与此一致，western blot分析进一步证实了IRI小鼠肾组织中Vim、S100a6和Ier3的上调，这与肾小管损伤标志物Kim-1水平的升高相一致。（图10B）

研究总结：本研究中，浸润性巨噬细胞在IRI诱导的AKI中起着关键作用。在浸润的巨噬细胞中Vim、S100a6、Ier3和Ccr1的表达增加可能与炎症反应有关，并可能介导巨噬细胞和肾小管上皮细胞在IRI条件下的相互作用. 这揭示了Ier3在AKI中的作用。研究结果表明了Vim、S100a6、Ier3和Ccr1是AKI的潜在治疗靶点。