易基因｜3文聚焦：DNA甲基化对果实成熟的重要作用（橙+番茄+草

2022-01-13 本文已影响0人表观遗传学爱好者

大家好，本期我们通过3篇高分文章来聚焦DNA甲基化对果实成熟的重要作用。

01 橙果实发育

标题：Global increase in DNA methylation during orange fruit development

and ripening（甜橙果实发育和成熟过程中全基因组DNA甲基化增加）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.

2021影响因子: 11.205

发表时间：2019.01

方法：WGBS、RNA-seq

摘要

DNA甲基化是参与许多生物过程的重要表观遗传标记。已有研究表明，番茄在成熟过程中全基因组DNA甲基化会显著降低，但其他水果的成熟是否与全基因组DNA去甲基化有关还尚不清楚。作者鉴定了甜橙果实的单碱基分辨DNA甲基化情况。与未成熟的甜橙果实相比，成熟的甜橙果实在3万多个基因组区域获得了DNA甲基化，在大约1000个基因组区域失去DNA甲基化，这表明在甜橙果实成熟过程中全基因组DNA甲基化显著增加。DNA甲基化的增加与DNA去甲基酶基因表达的降低有关。DNA甲基化抑制剂的应用干扰了甜橙果实的成熟，这表明DNA高甲基化是甜橙果实能够正常成熟的关键。作者发现，成熟相关的DNA高甲基化与数百个基因(如光合作用基因)的抑制和数百个基因(包括与脱落酸反应有关的基因)的激活有关。作者的结果表明DNA甲基化在甜橙果实成熟过程中起着重要作用。

材料

纽荷尔甜橙(Citrus Sinensis Osbeck)果实，采集了开花后90、120、150、180和210d的五个不同发育阶段的果实。采集橙果皮，并保存在−80°C，用于DNA和RNA的提取。

结果

为了研究甜橙果实发育过程中DNA甲基化的动态变化，作者根据甜橙果实发育和成熟的时间，将果实分为开花后90d、120d、150d、180d和210d五个不同的阶段(以下简称CS1∼CS5)进行单碱基分辨的全基因组DNA甲基化分析(图1A)。

作者发现DNA甲基化的增加主要是由于CHH甲基化的增加(图1B)。为了研究未成熟与成熟水果间的差异，作者比较了CS1和CS5两个阶段的DNA甲基化情况。如图1C所示，主成分分析(PCA)显示在每个阶段两个生物学重复具有很好的一致性。作者发现CS5中相对于CS1总共有120万个DMC，其中88%是高甲基化(hyper-DMC)，并且93%的高甲基化发生在CHH背景下，这表明CHH DNA甲基化主要从CS1增加到CS5(图1D)。

图1

由于在拟南芥、水稻胚乳、番茄发育过程中，整体的低甲基化会伴随着局部的高甲基化。作者想知道在橙子成熟过程中是否也存在同样的现象。进一步研究表明橙子果实成熟过程中CHH的高甲基化并不伴随CG的低甲基化(图2)。而且甜橙果实发育和成熟期间全基因组DNA甲基化增加，与番茄果实成熟期间全基因组DNA甲基化减少形成鲜明对比。

图2

DNA甲基化状态可由DNA甲基转移酶和DNA去甲基酶活性动态调节。甜橙果实发育成熟过程中DNA甲基化增加可能是由于DNA甲基转移酶活性增强或DNA脱甲基酶活性降低所致。为了研究这些可能性，作者检测了DNA甲基转移酶和脱甲基酶基因在甜橙果实发育和成熟不同阶段的表达水平。结果表明，成熟过程DNA脱甲基酶基因表达减少可能是引起DNA甲基化增加的原因(图3)。

图3

通过对DNA高甲基化相关基因分析，作者发现数百个基因启动子区域的甲基化与基因表达的阳性和阴性变化均有关联，分析表明：参与光合作用、细胞壁维持和发育的基因下调；脱落酸信号传导（对成熟很重要）以及类固醇和芳香族代谢相关基因的上调。并且将DNA甲基化抑制剂注射到甜橙果皮中可以阻止橙子脱绿（成熟）(图4)。

图4

02 番茄果实发育

标题：Critical roles of DNA demethylation in the activation of

ripening-induced genes and inhibition of ripening-repressed genes in tomato

fruit（DNA去甲基化在番茄果实成熟诱导基因激活和成熟抑制基因抑制中的关键作用）

期刊：Proc Natl Acad Sci U S A.

2021影响因子: 11.205

发表时间：2017.05

方法：CRISPR/Cas 9、WGBS、RNA-seq

摘要

DNA甲基化是一种保守的表观遗传标记，对植物和哺乳动物基因组的完整性、发育和环境反应非常重要。植物中活跃的DNA去甲基化是由一系列5-mC DNA糖基化酶/裂解酶(即DNA去甲基酶)启动的。最近的报道表明，活跃的DNA去甲基化在番茄果实成熟过程中起着重要作用。在本研究中，作者获得了番茄基因SlDML2的功能缺失突变体，该基因与拟南芥DNA去甲基酶基因ROS1同源。在番茄突变体的果实中，发现数千个基因的DNA甲基化增加。这些基因不仅包括数百个成熟诱导基因，还包括许多成熟抑制基因。作者的结果表明SlDML2在番茄果实成熟过程中起着关键作用，成熟诱导基因的激活和成熟抑制基因的抑制都需要活跃的DNA去甲基化。

材料

本研究所用植物材料均为第一代(T0)愈伤组织再生植株。所有的组织培养步骤都是在室温下进行的，光周期为16h光照，8h黑暗。

结果

作者利用CRISPR/Cas 9技术获得了番茄sldml2突变体，与WT植株的果实成熟相比，sldml2突变体的果实成熟明显受到抑制(图1)。

图1

在sldml2突变体中，高DMR的数量远远高于低DMR的数量，这与推测SlDML2在DNA去甲基化中的功能是一致的。为了研究SlDML2在DNA去甲基化中的作用，作者重点研究了sldml2突变体中的高DMR(图2)。SlDML2基因与拟南芥中的DNA去甲基化酶基因ROS1高度同源。

图2

作者分析了番茄品种果实成熟过程中DNA甲基化的变化，通过对比野生型与突变体间成熟过程中的差异甲基化区域（高甲基化、低甲基化区域），发现SlDML2是果实成熟诱导的DNA去甲基化所必需的(图3)。由于该基因的失活，使得全基因组范围内的甲基化水平升高，诱导果实成熟的基因表达受到抑制，导致番茄果实不能正常成熟。

图3

进一步研究表明，SlDML2 参与了色素合成、口味形成、乙烯生物合成及信号传导途径、细胞壁水解等调节机制，还参与调控了成熟相关基因的表达。另外，作者还发现，SlDML2介导的DNA去甲基化也抑制了部分参与光合作用及细胞壁合成的基因表达，这些基因大多是果实成熟所不需要的。

03 草莓果实发育

标题：Downregulation of RdDM during strawberry fruit ripening（草莓果实成熟过程中RdDM的下调）

期刊：Genome biology

2021影响因子: 13.583

发表时间：2018.12

方法：MS-PCR、WGBS、RNA-seq、sRNA-seq、VIGS

背景

近年来，DNA甲基化被多项研究证实与调控肉质果实的成熟有关。肉质水果可以根据其成熟过程区分为跃变期水果，如西红柿；或非跃变期水果，如草莓。由于DNA脱甲基酶基因的表达增加，番茄在成熟过程中DNA甲基化水平整体下降。但非跃变期果实成熟过程中DNA甲基化的变化情况和生物学相关性尚不清楚。

材料

草莓(Fragaria×ananassa Duch. cv.

Hongjia)是在浙江省农业科学院海宁科研创新基地种植的。收获了三个发育阶段的果实(Fa1，绿色期，开花后约20天(DAB)；Fa2，中间红期，30DAB；Fa3，全红期，35DAB)。在收获当天转移到实验室后，选择了大小均匀、没有明显缺陷的果实。每个发育阶段使用两个生物重复，每个重复8-12个果实。

结果

作者整合了未成熟和成熟时期草莓全基因组DNA甲基化分析结果，观察到草莓果实成熟过程中DNA甲基化会整体下调(图1、2)，因此，成熟诱导的DNA低甲基化不仅发生在跃变型果实中，也发生在非跃变型果实中。