四种碱基的判读-Hiseq测序原理2

本文回答以下两个问题：
1. 根据扫描得到的光点图，如何判断一个位置上的碱基是什么
2. 评估1中判断的可靠性

插图全部来自【陈巍学基因】视频2：HiSeq工作原理，本文是对该视频的学习笔记

1. 四种碱基的判读规则

• C > 0.6 即 Ia/Ib > 1.5，该位置的碱基是“好碱基”
• Ia ：光点中占比最高的荧光素含量
• Ib ：光点中占比第二的荧光素含量
• Pass Filter:前25个碱基中，坏碱基的个数小于等于1，则该read的Pass Filter=pass，否则不pass

• 对data进行Pass Filter的目的：去掉多克隆cluster
• 多克隆cluster中光点上，占比最高的荧光素含量与占比第二的荧光素含量相近，判读误差大，无法确定到底是哪种碱基
• PF rate = Pass Filter的reads数目/总的测到的reads数目
• 上样密度过高，PF rate 会下降（多克隆cluster会增多）

2. 评估碱基判读

Quality Score

• 评价一个位置上碱基判读可靠性的指标，评价碱基误判的可能性

  
  

• Q30比例 = 达到或超过Q30的数据 / 总的Pass Filter的数据

  
  

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