ATAC-seq 及其升级版Omni-ATAC

最近在学习ATAC-seq，整理了笔记分享一下，欢迎批评指正

a、为啥要ATAC-seq?

ATAC-seq全称Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，即利用转座酶研究染色质可进入性的高通量测序技术。

要理解这项技术的作用，首先需要认识染色体/质的结构。

真核生物的核DNA并不是裸露的，而是有蛋白质即组蛋白与之相结合的。DNA一圈一圈地缠绕在组蛋白上，形成串珠式的结构。而这样的结构还能够进一步折叠、浓聚，并在其他架构蛋白的辅助下，形成染色体。

这样做的意义在于，能够将超长的DNA链，折叠成很小很小的结构，从而塞进小小的细胞核里。比如说，人类的DNA链如果完整展开，那么大概会有2米那么长。而经过这样的折叠，就变成了纳米至微米级染色体/质的结构了。

这就好比我们在电脑中，将一个记录着ATCG四个碱基的纯文本文件，通过算法将其压缩成zip文件。

但是我们又知道，DNA的复制，基因的转录，是需要将DNA的高级结构解开的。这就类似于，要从zip文件中获得信息，首先需要解压缩。但是，这里的解压缩并不需要将整个zip全部打开，而只需要打开一部分，即需要表达基因的区域即可。而这一个过程，主要由染色体组蛋白的修饰（尤其是乙酰化）来实现的。

这部分打开的染色质，就叫开放染色质（open chromatin）。而染色质一旦打开，就允许一些调控蛋白（比如转录因子和辅因子）跑过来与之相结合。而染色质的这种特性，就叫做染色质的可及性（chromatin accessibility）。

我们如何去寻找开放的染色质区域呢？

传统的实验方法主要是借助MNase-seq和DNase I hypersensitivity assay。

这两个实验的主要思路是一致的：染色质变得开放，就意味着DNA和组蛋白的浓聚程度降低，就会有一部分DNA暴露出来。而一旦失去了蛋白质的保护，这部分DNA就可以被DNA酶（MNase或DNase I）所切割。然后，我们再把切割完的DNA拿来测序，和已知的全基因组序列相比较，就能发现被切掉的是哪些地方，没有被切掉的地方又在哪里，从而获知开放的染色质区域。

不过，这两个方法都有明显的缺陷，即耗时费力与重复性差。具体就不展开讲，亲手做过的就知道这两个方法有多么讨厌。

b、ATAC-seq原理和结果

2013年，美国Stanford大学的William Greenleaf教授研发了一种全新的方法，利用DNA转座酶结合高通量测序技术，来研究染色体的可进入性，即ATAC-seq。

DNA转座，是一种把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另外一个区域的现象，由DNA转座酶来实现。这种转座插入DNA，也是需要插入位点的染色质是开放的，否则就会被一大坨高级结构给卡住。

那么，如上图a，我们只要人为地，将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带着红色蓝色测序标签的转座酶Tn5），加入到细胞核中，再利用已知序列的标签进行PCR后测序，就知道哪些区域是开放染色质了。而这也就是ATAC-seq的原理。

即为了找到开放染色质区，基因组被TN5转座酶处理。在ATAC-Seq中，修饰后的TN5将与NextEra接头相对应的DNA序列插入到基因组的开放区域，同时，DNA被转座酶的活性剪切。

ATAC-seq出来的结果，和传统方法出来的结果具有很强的一致性，同时也和基于组蛋白修饰marker的ChIP-seq有较高的吻合程度。也就是说，ATAC-seq中的peak，往往是启动子、增强子序列，抑制子，以及一些反式调控因子结合的位点。

启动子是靠近转录起始点(TSS)的DNA区域。它包含转录因子的结合位点，这些转录因子将招募RNA聚合酶。增强子是可位于启动子下游或上游1Mb的DNA区域。当转录因子与增强子结合，并与启动子区域接触时，该基因的转录增加。相反，抑制子会减少或抑制基因的表达。

相比起来，ATAC-seq的重复性，比MNase-seq和DNase-seq的更强，操作起来也更加简单，而且只需要很少的细胞/组织量，同时出来的信号更加漂亮。目前已经是研究染色质开放性首选的技术方法。

c、ATAC的升级版本---Omni-ATAC

据说，目前市面上的公司做ATAC-seq基本上采用的都是Omni-ATAC这套Protocal，稳定性比较好。

而Omni-ATAC到底怎么回事儿呢？

2017年12月，Greenleaf实验室发表在Nature Methods上的文章An Improved ATAC-seq Protocol Reduces Background and Enables Interrogation of Frozen Tissues（DOI: 10.1038/nmeth.4396）中详细的介绍的ATAC升级版---Omni-ATAC！！！

这个作者是不是有点眼熟，对，你没看错，就是那个首先发明ATAC的作者，他的实验室对ATAC方法进行的一次重要改进！

摘要是这么写的：We present Omni-ATAC, an improved ATAC-seq protocol for chromatin accessibility profiling that works across multiple applications with substantial improvement of signal-to-background ratio and information content. The Omni-ATAC protocol generates chromatin accessibility profiles from archival frozen tissue samples and 50-μm sections, revealing the activities of disease-associated DNA elements in distinct human brain structures. The Omni-ATAC protocol enables the interrogation of personal regulomes in tissue context and translational studies.

protocol的主要改进：

使用多种去污剂(such as NP40, Tween-20, and digitonin)，以提高通透效果和去除线粒体

裂解后用Tween-20洗，以更好地去除线粒体

转座酶切时使用PBS，以提高信噪比

protocol的链接：https://protocolexchange.researchsquare.com/article/nprot-6107/v1

主要步骤

收集细胞、离心，裂解、离心，清洗、离心，得到细胞核。

转座酶切反应。

clean-up。

PCR预扩增，qPCR确定扩增轮数，扩增。

文库浓度测定。

评价

作者评价：Omni-ATAC相比standard-ATAC和FAST-ATAC，有更好的适应性，适用于冻存样品，且线粒体污染较少，信噪比较高，耗材成本较低。

其他评价：

推荐这篇protocol是因为它是目前被测序公司广泛使用的ATAC-seq方法，有必要了解一下其中的技术细节。

本方法所需细胞数为5万，酶切前需破膜离心提核。

如果使用该方法可以成功建库的话，就只要照着做就行了。

对于提核有难度的细胞，有大佬推荐试试梯度离心。

对于免疫细胞，FAST-ATAC和Omni-ATAC哪个更合适，可能还需要更多的探讨。

文中T细胞是Omni略胜一筹，B细胞Omni明显胜出。

对于髓系细胞和造血干细胞，文中未有提及。坐等作者再次更新方法啦，学无止境

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