蛋白质表达与纯化

密码子优化

2019-11-27  本文已影响0人  临窗听风雨

  在大肠杆菌中进行异源蛋白质的表达时,有时会发现重组蛋白质的表达量很低,给后面的分离纯化造成很大的困难。有些技术人员可能比较困惑,表达的蛋白质不是毒蛋白,载体是商用载体,一般商用载体的启动子效率都很高,这也排除了转录水平低的问题。那为什么蛋白质表达水平还那么低,这种情况你就要考虑是不是密码子偏性的问题。
  什么是密码子偏性呢?可以这么理解,宿主经过千百万年的进化,密码子与反密码子之间已经形成了一个平衡,有些密码子出现的频率高,其对应的tRNA水平也就高,密码子频率低对应的tRNA水平也就低。如果插入的外源基因上携带大量在宿主中频率很低的密码子,那么对应的tRNA就会出现不够用的情况,宿主首先要保证自身的蛋白质合成,剩下的才能用于异源蛋白质的合成,虽然宿主可以提高tRNA的水平,但对于异源蛋白质来说,合成的晚了或者慢了,就会引起翻译过程一系列的连锁减慢,合成的效率就会严重下降。
  基于这一原理,要提高某一基因在异源宿主中的表达量,常用的策略之一就是将目的基因的稀有密码子进行同义替换,使之更接近于宿主细胞的密码子使用方式。通过这种方法,提高外源基因在大肠杆菌宿主中表达量的报道已有很多。

外源型β-葡萄糖苷酶在大肠杆菌BL21(DE3)和Rosetta(DE3)(一种补充稀有密码子对应tRNA的大肠杆菌宿主)中的表达情况 [1]陈荫楠, 刘震, 石贤爱, et al. 密码子优化提高多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶异源表达量[J]. 中国生物化学与分子生物学报(4):101-109.
我硕士期间做的一个研究内容,以多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶为例,分析了密码子偏性程度并提出密码子替换的方式。感兴趣的同学可以找到该文献看一看。
[2]Gustafsson C, Govindarajan S, Minshull J. Codon bias and heterologous protein expression[J]. Trends in biotechnology, 2004, 22(7): 346-353.
这是一篇密码子偏性与异源蛋白表达的综述,对密码子偏性理论,密码子优化方式,密码子优化成果做了总结,很有参考价值。

  我这里制作了一个大肠杆菌所有密码子偏好的数据集,表中RSCU代表该密码子在所有同意密码子中的相对概率,计算方法为: [该密码子出现频率] / [同义密码子概率的和] × 同义密码子个数。可以根据密码子RSCU判断其偏性,进行密码子替换时,将RSCU值低的密码子替换成值高的密码子即可提高异源蛋白的表达量。

密码子 氨基酸 RSCU 密码子 氨基酸 RSCU 密码子 氨基酸 RSCU 密码子 氨基酸 RSCU
UUU Phe F 1.15 UCU Ser S 0.87 UAU Tyr Y 1.14 UGU Cys C 0.89
UUC Phe F 0.85 UCC Ser S 0.89 UAC Tyr Y 0.86 UGC Cys C 1.11
UUA Leu L 0.78 UCA Ser S 0.73 UAA Stop 1.94 UGA Stop 0.87
UUG Leu L 0.77 UCG Ser S 0.93 UAG Stop 0.19 UGG Trp W 1.00
CUU Leu L 0.62 CCU Pro P 0.63 CAU His H 1.14 CGU Arg R 2.28
CUC Leu L 0.63 CCC Pro P 0.50 CAC His H 0.86 CGC Arg R 2.42
CUA Leu L 0.21 CCA Pro P 0.76 CAA Gln Q 0.69 CGA Arg R 0.38
CUG Leu L 2.99 CCG Pro P 2.11 CAG Gln Q 1.31 CGG Arg R 0.59
AUU Ile I 1.53 ACU Thr T 0.66 AAU Asn N 0.90 AGU Ser S 0.90
AUC Ile I 1.26 ACC Thr T 1.75 AAC Asn N 1.10 AGC Ser S 1.67
AUA Ile I 0.21 ACA Thr T 0.51 AAA Lys K 1.53 AGA Arg R 0.22
AUG Met M 1.00 ACG Thr T 1.07 AAG Lys K 0.47 AGG Arg R 0.12
GUU Val V 1.03 GCU Ala A 0.64 GAU Asp D 1.26 GGU Gly G 1.35
GUC Val V 0.87 GCC Ala A 1.08 GAC Asp D 0.74 GGC Gly G 1.62
GUA Val V 0.62 GCA Ala A 0.85 GAA Glu E 1.38 GGA Gly G 0.43
GUG Val V 1.49 GCG Ala A 1.43 GAG Glu E 0.62 GGG Gly G 0.60

同时,也给出两个做密码子优化的网页工具:OPTIMIZERJcat。Optimizer进行密码子优化时会考虑GC含量、密码子平衡(如果将全部低频密码子换成最高频密码子,会导致细菌表达压力过大,不利于自身生长,这也是不行的),还可行规避酶切位点,自己指定参考集等,功能强大,推荐使用该工具。Jcat简单粗暴,直接将低频密码子替换成高频密码子。如果你只有蛋白质序列可以使用我自己编写的一个工具:http://www.liuzhen106.com/tools/103_2.html
  什么进化压力导致了密码子使用偏性,还没有定论。一些研究者推断,密码子偏性能够减少同工tRNAs的多样性,一些稀有密码子的tRNAs含量较少,有利于生物在快速生长条件下节约部分能量,从而降低了新陈代谢负荷。不管是什么原因导致了密码子偏性,但密码子偏性对异源蛋白表达水平确有深远的影响。

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