对于ATAC文库而言，其插入片段的长度分布有着非常典型的规律，示意如下

image.png

每200bp会存在一个峰，这个周期性波动反应的是核小体的个数。在ATAC_seq的数据分析中，会对插入片段长度分布进行可视化，观察其是否符合这样的周期性规律，一定程度可以反映文库构建的质量，那么如何在做这样一张分布图呢?

比对之后我们会得到bam文件，画图所需的插入片段长度就需要从bam文件中提取，需要注意，这里的插入片段是文库中adapter之间的插入片段，即fragment， 需要和insert size区别开来。

1.自己构建长度文件+R脚本

对于单端测序而言，只有bam文件是不够的，需要借助工具来预测fragment length, 这里就不展开了。对于双端测序而言，事情就变得简单了。bam文件的第9列直接存储了fragment length的信息，直接提取之后就可以用来画图，提取的代码如下

>samtools  view input.bam | \
awk -F'\t' 'function abs(x){return ((x < 0.0) ? -x : x)} {print $1"\t"abs($9)}' | \
sort | uniq | cut -f2 > fragment.length.txt</pre>

bam文件中每一行以reads为单位，这里去重是为了避免来自同一个fragemnts的reads重复统计。提取好之后，用R画图就可以了，R代码如下

data <- read.table("fragment.length.txt", header = F)  
# 设置插入片段长度的阈值，过滤掉太长的片段
length_cutoff <- 1200
fragment <- data\$V1[data\$V1 <= length_cutoff]   
######
##Part1：基础语法画图
###### 
# 利用直方图统计频数分布，设置柱子个数
breaks_num <- 500
res <- hist(fragment, breaks = breaks_num, plot = FALSE) 
# 添加坐标原点
plot(x = c(0, res\$breaks),
     y = c(0, 0, res\$counts) / 10^5,
     type = "l", col = "red",
     xlab = "Fragment length(bp)",
     ylab = expression(Normalized ~ read ~ density ~ 10^2),
     main = "Sample Fragment sizes")
######
##Part2：ggplot2 画图及其拼图
######
## 不同数据分布
DATA <- data.frame(x1 = c(0, res$breaks),y1=c(0, 0, res$counts) / 10^2)
p1 <- ggplot(DATA,aes(x =x1,y = y1 ))+
  geom_line(col="red")+
  xlab("Fragment length(bp)")+
  ylab(expression(Normalized ~ read ~ count ~ 10^2))+
  ggtitle("Sample Fragment sizes")+
  theme_classic()
  
## 画小图
DATA2 <- data.frame(x1 = c(0, res$breaks),y1=log10(c(0, 0, res$counts) / 10^2)+1)
p2 <- ggplot(DATA2,aes(x =x1,y = y1 ))+
  geom_line(col="red")+
  xlab("Fragment length(bp)")+
  ylab(expression(Normalized ~ read ~ count ~ (log)))+
  ggtitle("Sample Fragment sizes")+
  theme_classic()


## 小图插入右上角
library(cowplot)
ggdraw() +
  draw_plot(p1, 0, 0, 1, 1) +
  draw_plot(p2, 0.5, 0.52, 0.5, 0.4) +
  draw_plot_label(c("A", "B"), c(0, 0.5), c(1, 0.92), size = 15)

######
##Part3：其他（密度图）
######
P3 <- ggplot(as.data.frame(fragment))+
  geom_density(aes(x=fragment),bw=3,color = "red")+
  xlim(0,NA)+
  scale_y_continuous(breaks = c(seq(0,0.004,0.001)),
                     labels=c(seq(0,4)),
                     name = expression(Normalized ~ read ~ density ~ 10^-3))+
  theme_classic()

输出结果示意如下

2 deeptools的bamPEFragmentSize

需要安装deeptools，下载安装参考官网：
deepTools: tools for exploring deep sequencing data — deepTools 3.5.0 documentation

不确定的话，用如下命令检查是否安装成功

deeptools -h

出现如下界面：表示安装成功！！可以直接调用

插入片段分析图命令：

bamPEFragmentSize \
-hist Control_rep1.fragmentSize.png \     #图片文件名称
-T "Fragment size of PE ATAC-seq data" \       #标题
--maxFragmentLength 1000 \                      #设置最大长度
-b testFiles/RNAseq_sample1.bam testFiles/RNAseq_sample2.bam testFiles/RNAseq_sample3.bam testFiles/RNAseq_sample4.bam \     #输入bam文件
-samplesLabel sample1 sample2 sample3 sample4   #标签

结果如下：

也可以添加其他参数，参考bamPEFragmentSize — deepTools 3.5.0 documentation的说明

优点：能很快出结果
缺点：不能过滤掉“0”

---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------I`m a line ! Thanks !-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

参考：(https://www.jianshu.com/p/0a8d57dbfc3c)