纯生信分析系列 Nature|溃疡性结肠炎中结肠CD8 + T细

good morning !小伙伴们，我们又见面啦！今天我们又要介绍一篇单细胞图谱文章，于2020年8月3日发表于nature medicine，题目为Single-cell atlas of colonic CD8+ T cells in ulcerative colitis，作者使用单细胞转录组学与TCR分析以及质谱分析技术，对健康人和溃疡性结肠炎（UC）中结肠CD8 + T细胞进行分析，揭示了CD8 + T细胞组成中广泛的异质性。

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研究背景

什么叫IBD?

IBD是一种胃肠道的慢性炎症性疾病，其特征是临床复发和缓解交替出现，分为两种主要的亚型，克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。

病因学相关因素

1.环境因素：明显的地域差异，IBD首先在北美、北欧最早增长，然后是西欧、南欧，最后是日本、南美。

2.遗传因素：一级亲属发病率显著高于普通人群，而其配偶发病率并不增加。CD发病率单卵双胎高于双卵双胎。目前认为，IBD不仅是多基因病，而且也是遗传异质性疾病，即不同人由不同基因引起，病人在一定的环境因素下由于遗传易感而发生。

3.感染因素：虽然微生物在IBD中的作用相关文献很多，如CD可能与副结核分枝杆菌及麻疹病毒有关，但迄今未检出某一特异微生物病原与IBD有恒定关系。

4.免疫因素：粘膜免疫系统具有重要的作用，如UC的T细胞反应趋于低下，CD的T细胞效应功能增强。除此以外，肠非免疫细胞如上皮细胞、血管内皮细胞等可以在肠道炎症反应中释放炎症介质，以及参与炎症损害的各种物质如反应性氧代谢物和NO等。

结果分析

（1）人体结肠CD8 + T细胞状态的拓扑学。首先，作者对3名健康人与3名UC患者的结肠CD8+T细胞进行单细胞转录组送测序，共捕获8,581 个细胞，可以分成14个亚群（图1a-b）,并且对细胞亚群进行命名（图1c-d）。根据特异性标记基因进行标记后，发现幼稚性T、记忆T、组织驻留T、效应T、双阳DPT、MAITs 、IELs 和IL26+CD8+T等。然后作者对不同细胞亚型中的差异基因进行GO分析发现，在DP双阳细胞和IL26+细胞中富集IL-17通路，在ILE亚群和部分IL26+细胞中富集NK通路（图1f）。数据分析揭示了克隆CD8+T细胞的异质性，包括同时具有天然免疫和适应性免疫特征的IL26+T细胞以及DP双阳调节性CD8 + T细胞。

图 1 单细胞分析工作流程

（2）UC中结肠CD8 + T细胞的比例变化。作者在UC中观察到明显的CD8+T细胞的组成变化，例如TRM样的T细胞在健康人中约占所有细胞的45%，而在UC患者中只有10%。同时作者观察到DPCD4+CD8+FOXP3+细胞的增加，TYROBP+ IELs减少，TYROBP-IELs增加（图2a-b）。然后作者探索结肠内IBD遗传易感基因座的转录情况，通过GWAS发现，在UC相关的基因座中特异性表达活动性炎症特征（图2c）。

 图 2 活动性UC中的结肠CD8 + T细胞重塑

（3）UC中上皮细胞和CD8 +亚群之间的互作发生改变。由于在UC中CD8 + T细胞可能通过与结肠上皮细胞的直接相互作用而导致UC组织损伤，因此作者利用CellphoneDB探索了健康人和UC中的T细胞和上皮细胞受体-配体结合。在健康人中CD8+与上皮细胞亚群间的配受对为15-51，在UC中配受对为14-80。非经典MHC分子HLA-E9在UC中的多个上皮亚群中被强烈诱导，而其相应的配体在CD8 + T细胞中被诱导表达。在吸收细胞中存在特异性配受对如IL18-IL18R1/IL18RAP和TNF-TNFRSF1A ，在其他细胞类型中并不存在（图2d，e）。

鉴于UC中产生IL26 +的CD8 +细胞数量增加，作者检查了健康和UC中结肠细胞中IL-26受体IL10RB / IL20RA10的表达。发现IL10RB定位于上皮中的结肠细胞，在健康和UC中由间充质细胞普遍表达，但在CD45 +细胞中却不表达，而IL20RA的表达量很低。相反，IL10RA表达仅限于CD45+细胞。整个组织中的IL26表达与炎症程度相关。这表明UC中IL-26信号转导的增加不是由于其受体的诱导表达所致。

图 3 转录模块，伪时序和克隆性定义UC CD8 + T细胞谱系

（4）转录网络调控UC中结肠CD8 +的可塑性。为了识别IBD中结肠CD8 + T细胞的调控网络，作者进行了基因共表达分析，并对每个细胞的基因模块活性进行评分。这些模块与转录因子（TF）顺式调控模序共表达并富集，从而鉴定出273条与TF活动相关的通路。作者观察到一组模块，包括EGR1和EGR2，它们的活性局限于TRM细胞和GZMK +效应细胞之间（图3a）。 这些过渡态细胞还表现出高水平的IFNG和TNF的局部共表达，以及FOS，FOSB，FOSL1，JUN和JUNB的活性（图1d）。TF活性分析不仅表明基因模块具有细胞状态特异性，而且还显示了IBD中的不同活性，包括ETV7，PRDM1 / BLIMP-1和STAT3。

（5）TCR分析定义了UC中多种CD8 +细胞表型的联系。作者对CD8+T细胞进行伪时序分析，捕获了从幼稚型细胞到记忆，TRM，GZMK +效应T并最终达到IL26 +细胞的线性轨迹（图 3b，c）。为了了解驱动伪时序线性轨迹的生物学过程，作者进行了基因相关性分析（图3d），并鉴定了早，中/中到晚和晚表达的基因模块。与细胞亚群分布保持一致，幼稚和早期的中央记忆T细胞标记基因（如CCR7）较早表达，而共抑制受体（HAVCR2，CTLA4）较晚表达（图3d，e）。正如伪时间簇分布所表明的，首先T细胞活化标记基因的高表达，以及共抑制分子的逐渐增加。同时作者观察到BATF，CTLA4，HAVCR2，LAYN和TNFRSF9的表达增加，而与效应功能相关的分子（例如GZMK）却逐渐表达降低（图3c-e）。

然后作者进行了单细胞TCR-αβ分析发现幼稚T，MAIT和DP T细胞表现出多样的克隆结构，大多数细胞表达独特的TCR CDR3序列对（图3f），并且在UC相关的IL26 +细胞中发现了明显的T细胞克隆富集（图3g）。在3,835种独特的克隆中，共有320种出现在一个以上的细胞亚群中（图3h）。克隆中重叠较多的细胞亚群分别是TRM和IL26 +，GZMK +效应T和记忆细胞之间。

图 4  利用CITE-seq对蛋白与转录组数据整合

（6）结肠CD8 + T细胞的多组学分析证实了UC中的异质性和重塑。然后作者通过CITE-seq结合蛋白和转录组测序，对7个UC和五个健康样品进行分析（图4a）。发现与先期的单细胞分析可以有很好的复现（图4b-d），并且可以将效应T分为两个其他细胞亚群，包括TNF (TNF+ 效应T)和EGR1/EGR2 (EGR1+效应T)。然后作者通过CITE-seq验证转录水平在蛋白上的表达情况，例如共抑制因子PD1，TIM3和LAG3标记CD103+细胞等（图4e-f）。

图 5 使用CyTOF对CD8+T细胞进行分析

（7）UC中CD8 + T细胞的数据整合和功能分析。作者开发了一种整合39个细胞特异性标记基因的质谱流式（CyTOF）（图5a，b）,许多关键标志物在蛋白质和mRNA数据集中均显示出共表达（图5c，d）。在某些亚群（例如，CCR7 + /幼稚细胞）中观察到了mRNA与CyTOF之间的大量一对一关系，而一对多的关系则强调了在scRNA-seq数据指导下将CyTOF细化的必要性，使其更准确捕获离散的表型状态。为了评估与UC相关的CD8 +亚群的功能，我们使用PMA和离子霉素进行体外刺激。发现不同供体组均出现表达TNF-α和IFN-γ的CD103 + TRM细胞亚群的出现。相比之下，来自UC供体的再激活细胞也富含GZMK +效应因子的标记基因（图5e–g）。很少有IL23R +细胞（主要包括IL26 +，一些MAIT和DP细胞）对刺激产生反应。这些结果表明，在UC中观察到的克隆扩增的IL23R + / IL26 +细胞可能具有有限的效应功能，这与其转录的“后效应因子”终末分化特征一致。在缺少IL23R的情况下，在TNF-α/IFN-γ亚群中也诱导表达IL-17（图5g），这表明UC中的粘膜CD8 + T细胞在转录上更倾向于采用Tc17样细胞表型。

图 6  IL-26减轻急性结肠炎的严重程度

（8）IL-26减轻急性结肠炎的严重程度。IL-26在结肠炎中的作用尚不清楚， 即使啮齿动物中不存在IL26基因，其包含IL-20RA和IL10RB的异二聚体受体仍在小鼠中表达，并且可以响应人类IL-26发出信号。作者使用了人源化的IL-26转基因（hIL-26Tg）小鼠模型来评估IL-26是否可以影响急性结肠炎的严重程度。与同窝对照或同胞野生型（WT）C57BL / 6J（B6）小鼠相比，hIL-26Tg小鼠的结肠在稳态下无差异。作者将hIL-26Tg和对照B6小鼠暴露于饮用水中的2.5％葡聚糖硫酸钠（DSS）中，并在第0天和第3天腹膜内给予抗IL-26单克隆抗体（mAb）或对照mAb处理hIL-26Tg小鼠（ 图6a，b）。给予对照抗体的DSS-WT小鼠的总炎症评分显着高于被DSS-hIL-26Tg小鼠。在同时给予抗IL-26 mAb后，在这些hIL-26Tg小鼠中恢复了DSS的炎症作用（图6c，d），表明IL-26在急性炎症期具有潜在的保护作用。并且通过RNA-seq发现在DSS刺激下hIL-26Tg小鼠中促炎细胞因子（例如Tnf）和趋化因子水平较低。基于这些结果，作者提出IL-26的作用与细胞因子（例如，Il33和Tnf）在促进急性实验性结肠炎中肠屏障完整性或粘膜损伤的促进作用之间的联系。

参考文献

Corridoni D, Antanaviciute A, Gupta T, et al. Single-cell atlas of colonic CD8+ T cells in ulcerative colitis [published online ahead of print, 2020 Aug 3].Nat Med. 2020;10.1038/s41591-020-1003-4. doi:10.1038/s41591-020-1003-4

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