转录组学习笔记1
基因课视频笔记——仅用于个人学习
转录组原理篇
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由于一个物种的基因组差异不大，目前所说的基因组通常指一个物种的基因组，也称为参考基因组。
对于一个二倍体(人)，由于两套染色体差异不大，常说的基因组指单倍体加上性染色体。
转录组包括rRNA、tRNA、mRNA和ncRNA等，其中rRNA占了绝大部分，因此想要对mRNA进行研究时，必须首先去除rRNA。
对于转录组，一定要指明是某一组织/细胞在特定条件下基因的转录情况。
要研究某一基因的转录本，可以选择：
- 全长转录本测序（贵）
- 二代测序：将该组织/细胞的所有基因的转录本随机打断（假设有100个片段），从中随机挑选一定量的RNA片段进行建库测序（假设一次只能测5个片段，测了10次）
通过二代测序与参考基因组比对，可以得到：
- 序列信息（合成并推测序列）
- 变异信息（与参考基因组不同的地方）
- 基因/转录本的表达量（reads count，比对到基因/转录本上的reads数目）比对时必须考虑到该基因/转录本的长度
在实际进行转录组测序时，可能没有与参考基因组相比对，这些数据也能使用，只是质量略差
转录组测序评判
混淆矩阵
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准确率与召回率
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特异性/敏感性/ROC
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以假阳性率（1-特异度）为x轴，真阳性率为y轴，绘制出来的就是ROC曲线
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转录组分析流程
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人类有参考基因组，所以可以进行比对（mapping）
通过计算落在比对基因上的reads count就可以算出基因的表达量；
也可以优化基因结构；
发现新的转录本；
转录组测序设计
需要几个重复
Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2
技术重复（成本高）
生物学重复目前的最低要求是3对样本（要得到可靠结果至少需要10个样本）
需要多少数据量
- 研究差异表达时，需要大部分基因能被检测到，且大部分基因上有不少于10条reads，数据量在10-25M比较合适
- 研究可变剪接时，需要reads落在外显子内含子交界，因此需要更多数据量（>50M）
- 在没有参考基因组时，需要进行denovo拼接，至少要100Mreads
这里所说的M是按reads的条数来算的，代表了抽样次数
采取双端测序时，map到同一位点上的reads只能算一条
20Mreads换算成碱基为6Gb
混池测序
- 混池相当于求平均值，会丢失异常值信息和组内差异信息（假阳性高），因此研究差异表达时不建议用混池测序（大量样本时可以尝试）
- 可以用于研究转录本序列
Trinity拼接原理
- inchworm algorithm
将reads打断为k-mer，通过对k-mer延申，输出countig序列 - chrysalis
通多countig序列以及k-mer之间的关系，构建德布鲁因图（一张图对应一个基因，不同路径代表不同剪接形式） - butterfly
根据reads对各个路径的支持选择最优路径，打印输出
比对参考序列
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比对软件选择
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比对结果可视化，显示比对到基因不同位置的reads比例
QoRTs
RPKM / FPKM / TPM
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因此需要对基因长度，测序深度，总reads数进行标准化
RPKM
FPKM
TPM：
-
对基因长度进行标准化
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将第一步标准化的结果按样本求和，再对测序深度进行标准化
TPM考虑了基因外显子的长度，更适合表达相对定量的分析，而FPKM和RPKM没有考虑这一点
TPM vs RPKM
TPM vs FPKM
样品间表达标准化
某一样本中单一基因的表达是相对的，想对不同样本间这一基因的表达进行研究，就需要对样本间的表达进行标准化
方法：
- 管家基因（内参）：由于管家基因较少，可靠性不高
- 假设：大多数基因在样本间没有差异表达
再通过统计学方法找到标准化因子
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组内比较用TPM
组间比较用TMM
差异分析
通常用t检验
I类错误（假阳性）的值 = 用于界定的p值
对大量基因进行差异分析时，选择FDR对p.value进行校正，得到q-value
II类错误 通过增加样本量，重复测序减少
