免疫组化加生信分析验证基于PD-L2的免疫特征可作为抗PD-1治

PD-L2 based immune signature confers poor prognosis in HNSCC

基于PD-L2的免疫特征赋予HNSCC较差的预后

发表期刊：Oncoimmunology

发表日期：2021 Aug 4

影响因子：8.110

DOI:  10.1080/2162402X.2021.1947569

一、背景

        2018年全球有超过80万个头颈部肿瘤新病例的报道。每年有超过40万患者死于该疾病，其中约90%的患者为头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）亚型。约19-46%的HNSCC患者被诊断为淋巴结转移，15-50%的患者在接受标准护理治疗后出现肿瘤复发。

        越来越多的证据表明，人类癌症（包括晚期HNSCC）的肿瘤微环境中存在免疫失调。PD-1，也被称为CD279，是一种重要的免疫抑制检查点分子，主要表达于活化的B细胞、NK细胞、T细胞和APCs。通过靶向PD-1/PD-L1轴阻断免疫检查点可以改善复发性/转移性（R/M）HNSCC患者的生存率。PD-L2是PD-1的另一个配体，在某些功能上与PD-L1相似，主要影响调节性T细胞。

二、材料与方法

1.数据来源

1）59名接受手术的HNSCC患者

2）HNSCC标本：包括61个原发性HNSCC组织、8个转移性HNSCC组织和11个正常舌组织

2.实验流程

1）免疫组化中的样品去糖基化

2）生存树分析模型：使用最小深度和可变重要性（VIMP）建立了生存树分析（STA）模型；采用Kaplan-Meier分析法对结点进行评估

3）体内异种移植肿瘤模式：小鼠实验

4）循环肿瘤细胞的分离、TILs的分离和分析

5）单细胞测序：GSE163872

6）通路分析和基因组富集分析：基因组富集分析（GSEA）用于分析scRNA-seq数据

7）统计学分析：采用Mann-Whitney U检验或Wilcoxon配对t检验、McNemar或chi-squared检验和ANOVA检验进行分析；多变量Cox回归模型和Kaplan-Meier分析被用来评估生存率

三、实验结果

01、PD-L2在大多数HNSCC患者中都有表达

        研究共纳入59名HNSCC患者，大多数患者是男性（69.49%）和吸烟者（61.02%），其中28例口腔原发性肿瘤。记录了48例（81.4%）死亡，中位随访时间为45个月。所有肿瘤标本用于分析PD-L2和PD-L1表达的患者在诊断时均接受手术，未接受任何新辅助治疗，包括化疗或放疗。

        IHC染色显示PD-L2在大多数肿瘤中表达（图1a），此外，PD-L2水平与AJCC分期密切相关（图1b）。与非转移性肿瘤相比，淋巴结转移性肿瘤样本中的瘤内PD-L2+细胞密度明显较高（图1c）。59份标本中有15份检测到PD-L1的表达，PD-L1阳性肿瘤细胞的染色密度和强度明显弱于PD-L2阳性肿瘤细胞，肿瘤中PD-L1和PD-L2的表达密切相关。此外，61.36%的肿瘤标本在PD-L1阴性的样本中为PD-L2阳性（图1d）。与只表达PD-L1的标本相比，同时表达PD-L2和PD-L1的标本以及只表达PD-L2的标本更为常见。这些结果表明，HNSCC样本的瘤内PD-L2水平高于PD-L1，表明在没有PD-L1的情况下，PD-L2在免疫抑制中起着代偿作用。

        43个HNSCC标本在基质中呈PD-L2阳性。肿瘤中PD-L2阳性细胞的密度高于基质中的密度，但是差异没有统计学意义（图1e）。另外，PD-L1在基质中的表达也没有统计学意义。肿瘤表达PD-L1和PD-L2在基质中的表达强度没有关联。

        作者进一步验证了PD-L2在HNSCC标本中的表达（图1f），其中包括61个原发性HNSCC组织、8个转移性HNSCC组织和11个正常舌组织。86.96%的肿瘤标本为PD-L2阳性，与原发肿瘤和非肿瘤组织相比，转移性肿瘤表现出更高的PD-L2水平（图1g）。

图1 PD-L2在HNSCC标本中的表达和分布

02、HNSCC标本的PD-L2表达和临床病理学特征

        PD-L2的表达与淋巴结转移、AJCC分期和分化等级成正相关。在单变量分析中，原发部位、淋巴结转移、分化等级和临床分期（AJCC 2018）、瘤内PD-L2、CD3、CD8和基质CD3与预后不良有关。62.5%的肿瘤在淋巴结转移的患者中显示中度或高度的PD-L2染色。PD-L2和CD8的状态是肿瘤的独立预后因素。

03、PD-1的表达与PD-L2的表达有关

        PD-L2通过与PD-1阳性TILs结合，在HNSCC的免疫逃逸中起着重要作用。38.98%的肿瘤标本为PD-1阳性TILs。PD-1阳性细胞显示出较高的CD8表达水平，PD-1+TILs与CD8+TILs呈正相关（图2a）。值得注意的是，PD-1+TILs的中位数与PD-L2表达强度呈正相关（图2b）。

        观察到四种不同的肿瘤微环境：I型为适应性免疫抵抗，32%，有TIL和PD-L1表达的病例中观察到；II型为免疫忽视 ，22%，同时缺乏TIL、PD-L1或PD-L2的病例中观察到；III型为内在诱导，39%，有PD-L1和PD-L2表达且TIL缺乏的病例中观察到；IV型，耐受，7%，有TIL且缺乏PD-L1表达的病例中观察到（图2c）。此外，还经常观察到PD-L2和PD-1的存在而PD-L1的缺失（图2d）。

图2 HNSCC中PD-1、PD-L1和PD-L2表达的异质性

04、PD-L2在小鼠异种移植肿瘤模型的免疫抑制中起关键作用

        作者建立了一个C3H免疫能力小鼠模型，并研究了PD-L2在PD-L1存在的情况下的潜在作用（图3a）。PD-1或PD-L2的单克隆抗体（mAb）表现出明显的抗肿瘤作用，而PD-L1 mAb对肿瘤生长的抑制作用有限（图3b, c）。PD-L2 mAb组的TILs中活化的CD8+IFN-γ+ T细胞数量是PD-L1 mAb组的两倍（图3d）。在CD335+NK和NK1.1+NKT细胞数量中也发现类似的模式（图3e，f）。与PD-L1 mAb组相比，PD-L2 mAb组的细胞毒性T细胞活性升高，如粒酶B的免疫染色所示（图3g）。这些结果表明，用PD-1或PD-L2的mAb治疗可以极大地诱导免疫细胞在肿瘤中的浸润。此外，代表肿瘤高转移能力的CTCs在PD-1 mAb和PD-L2mAb组都明显减少（图3h）。

图3 PD-L2在体内的免疫抑制中起着决定性作用

        随着上述PD-L2在HNSCC中的抗肿瘤免疫作用的证明，作者进一步研究了免疫相关基因的表达与PD-L2之间的相关性（图4a）。在肿瘤体中，CD8+T细胞、CD3+T细胞和FOXP3+Tregs的密度大大低于基质中的密度（图4b）。在瘤内和基质区域，CD8+或CD3+T细胞的数量明显高于FOXP3+ Tregs的数量（图4b）。FOXP3+Tregs、CD3+T细胞和CD8+T细胞的数量在肿瘤体中呈正相关（图4c）。在肿瘤体中，PD-L2+肿瘤细胞的密度与CD3+T细胞、CD8+T细胞、FOXP3+Tregs（图4d）之间有正相关关系。然而，基质PD-L2与CD3、CD8和FOXP3之间没有明显关联。因此，PD-L2与肿瘤细胞中免疫相关基因的表达密切相关。

图4 HNSCC的免疫标志物表达

05、预测HNSCC的OS的预测模型

        作者验证了瘤内PD-L2的高表达具有较短的OS（图5a）。样本根据CD3（图4e）、CD8（图4e）和FOXP3（图4e）的表达被分为两组，与OS没有直接关系。作者假设免疫细胞可能由于肿瘤和基质的表达而对OS产生不同的影响。数据显示，CD3、PD-1和CD8的表达至少部分参与了OS（图5a）。评估具有不同生物标志物表达的T细胞亚群可能是预测HNSCC OS的更准确的预后标志。为了选择与生存有关的变量，本研究STA模型中包括了瘤内PD-L2和瘤内/基质CD3、PD-1、FOXP3和CD8的表达。

        作者发现瘤内CD3、CD8和PD-1水平对OS有明显影响。PD-L2是重要性分析中最具影响力的变量。虽然基质PD-1、基质CD8以及瘤内和基质FOXP3水平的VIMP评分为-0.0013、-0.0022、0.0011和-0.0026，但它们的最大值都比最小深度的临界值（0.9308）高；因此，它们被排除在STA模型之外（图5b）。

        本研究确定了六个节点，可以描述HNSCC或目前队列中的预后特征。携带瘤内PD-L2低基质CD3高的患者的预后标志与72个月的最佳中位OS有关，而最差的生存发生在第4个节点，中位OS为10个月（瘤内PD-L2高瘤内CD3低瘤内CD8低）（图5c）。值得注意的是，与瘤内PD-L2高瘤内CD3低瘤内CD8低特征的患者相比，瘤内PD-L2低基质CD3高特征的患者的预后指数预测的OS更长（图5d）。

图5 基于PD-L2的免疫特征与HNSCC患者的生存期有关

06、PD-L2与细胞因子IL-6有关

        为了研究PD-L2与其他因素之间的关联，作者使用scRNA-seq分析了来自两名HNSCC患者的PD-L2的表达（图6a）。根据细胞的全局表达模式将其划分为初步的集群，并通过特定的标记基因将集群注释为癌细胞、肌细胞、癌症相关的成纤维细胞、正常成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞。为了更好地分析癌细胞的异质性，作者进一步确定了癌细胞集群的子集群，癌细胞被进一步划分为六个集群，发现表达PD-L2高表达的细胞在集群2中被富集（图6b）。

        为了进一步了解PD-L2表达在临床中的作用，首先使用似然比检验来确定与其他集群相比，PD-L2富集的集群2中的差异表达基因（DEGs），确定了819个上调的DEGs，发现在这819个DEGs中包含了几个与预后不良有关的基因。根据GSEA分析，PD-L2高表达的相关特征在 "HALLMARK_HYPOXIA"、"HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE "和"HALLMARK_TNFA_SIGNALING_VIA_NFKB "组中富集。为了证实这一结果，进行了GSVA分析，以估计和比较每个簇的癌症标志相关状态。与其他集群相比，集群2显示属于 "HALLMARK_EPITHELIAL_MESENCHYMAL_TRANSITION"、"HALLMARK_HYPOXIA "和"HALLMARK_INFLAMMATORY_RESPONSE "组的基因表达较高（图6c）。特别是与Th2细胞因子反应有关的IL-6被确认为重叠基因，表明它与PD-L2高表达有关（图6d）。

        为了进一步验证PD-L2和IL-6之间的潜在相互作用，作者对59个人类HNSCC样本进行了IHC。共有59.32%的HNSCC标本为IL-6阳性，包括27.12%的弱染色，20.34%的中度染色和11.86%的强染色（图6e）。IL-6高表达的患者OS较差（图6f），IL-6水平与PD-L2水平呈正相关（图6g）。

        作者进一步调查了它与FOXP3、CD8和CD3的相关性，发现IL-6的表达与肿瘤中的CD8细胞呈正相关（图6g），提示PD-L2水平高的患者的生存不良是由较高的IL-6分泌引起。为了进一步验证这一假设，作者评估了PD-L2在体外对IL-6刺激的表达。PD-L2的mRNA和蛋白水平都因IL-6处理而明显升高（图6h，i）。这些结果表明，TH2相关的细胞因子IL-6有助于HNSCC中PD-L2的异常表达。

图6 PD-L2的表达与细胞因子IL-6的表达有关

四、结论

        作者定义了一个基于PD-L2的免疫特征，可以在HNSCC患者的队列中区分HNSCC的不同亚型的生存结果。强调PD-L2是一个很有前途的免疫检查点目标，并证明其在HNSCC中的预后价值。本研究还为在辅助治疗中使用抗IL6疗法提供了依据，以改善PD-L2水平高的HNSCC患者的免疫治疗方法。