RNASEQ分析入门笔记7- HTSeq定量基因表达水平

HTseq统计基因reads数

HTseq是用于分析基因表达量的软件，能够根据基因结构注释GTF文件对排序过的SAM/BAM文件进行基因reads数的统计。

语法：htseq-count [options]

mkdir -p ncbi/matrix/ 在ncbi目录下创建matrix文件夹，用于存放HTseq生成的.count文件。-p (-parents)，加上此选项后，系统将自动建立那些尚不存在的目录。

运行HTseq-count命令：

htseq-count ~/ncbi/aligned/SRR3589959_count.sam ~/ncbi/reference/mm10/gencode.vM10.annotation.gtf > ~/ncbi/matrix/SRR3589959.count
htseq-count ~/ncbi/aligned/SRR3589960_count.sam ~/ncbi/reference/mm10/gencode.vM10.annotation.gtf > ~/ncbi/matrix/SRR3589960.count
htseq-count ~/ncbi/aligned/SRR3589961_count.sam ~/ncbi/reference/mm10/gencode.vM10.annotation.gtf > ~/ncbi/matrix/SRR3589961.count
htseq-count ~/ncbi/aligned/SRR3589962_count.sam ~/ncbi/reference/mm10/gencode.vM10.annotation.gtf > ~/ncbi/matrix/SRR3589962.count

上述语法是将排序过的SAM文件（count.sam）进行reads数统计，并输出为.count文件（不用担心存储空间问题，每个文件仅1M左右）。此处，使用了绝对路径，也可以根据自己的情况选择使用相对路径。

为节省时间，可以将上述命令在4个终端中同时执行，大约需要2个小时左右可以完成，生成4个文件：

SRR3589959.count
SRR3589960.count
SRR3589961.count
SRR3589962.count

简单介绍一下.count文件的格式，在命令行下查看：

cd ~/ncbi/matrix # 切换到.count文件所在的matrix目录
head -n 10 SRR3589959.count # 使用head命令查看SRR3589959.count文件的前10行

输出如下：

ENSMUSG00000000001.4 1648
ENSMUSG00000000003.15 0
ENSMUSG00000000028.14 835
ENSMUSG00000000031.15 65
ENSMUSG00000000037.16 70
ENSMUSG00000000049.11 0
ENSMUSG00000000056.7 366
ENSMUSG00000000058.6 7
ENSMUSG00000000078.6 558
ENSMUSG00000000085.16 286

.count文件分为2列，第一列是基因名称（ENSMUSG00000000001.4），第二列是reads数（1648），由此可见，htseq-count命令的目的是将排序过的SAM文件（001，003，0028，0031，0037......）逐个统计reads数，但是，此时生成的.count文件只有两列。

因为所有的.count文件都排过序，并且共享相同的基因名称，所以下一步是将所有的.count文件合并起来，生成一个统一的文件，需要使用R语言脚本将4个.count文件合并为一个表达矩阵。

R语言脚本合并表达矩阵

R # 在命令行下输入R，进入R环境
options(stringsAsFactors = FALSE) #默认为TRUE，不要辨认为factors

# 59，61为对照组，60，62为处理组，首先将四个文件分别赋值为：control1，control2，rep1，rep2
control1 <- read.table("/Users/Administrator/ncbi/matrix/SRR3589959.count", sep="\t", col.names = c("gene_id","control1"))
control2 <- read.table("/Users/Administrator/ncbi/matrix/SRR3589961.count", sep="\t", col.names = c("gene_id","control2"))
rep1 <- read.table("/Users/Administrator/ncbi/matrix/SRR3589960.count", sep="\t", col.names = c("gene_id","rep1"))
rep2 <- read.table("/Users/Administrator/ncbi/matrix/SRR3589962.count", sep="\t",col.names = c("gene_id","rep2"))

# 将4个矩阵文件按照gene_id进行合并，首先组内合并，接着组间合并，并且赋值给raw_count
raw_count <- merge(merge(control1, control2, by="gene_id"), merge(rep1,rep2, by="gene_id"))

对raw_count进行赋值后，我们可以查看生成的合并矩阵：

raw_count # 查看合并矩阵

但是raw_count文件太长，只能输出19999行，显示达到最大输出量：

[ reached getOption("max.print") -- omitted 28826 rows ]

因此，我们只显示前10行数据，来查看一下生成的矩阵的格式：

head (raw_count, n=10) #查看raw_count的前10行

输出结果如下：

gene_id control1 control2 rep1 rep2
1 ENSMUSG00000000001.4 1648 2306 2941 2780
2 ENSMUSG00000000003.15 0 0 0 0
3 ENSMUSG00000000028.14 835 950 1366 1051
4 ENSMUSG00000000031.15 65 83 52 53
5 ENSMUSG00000000037.16 70 53 94 66
6 ENSMUSG00000000049.11 0 3 4 5
7 ENSMUSG00000000056.7 366 386 722 301
8 ENSMUSG00000000058.6 7 11 7 3
9 ENSMUSG00000000078.6 558 896 1265 1342
10 ENSMUSG00000000085.16 286 313 343 348

合并后的矩阵共有5列，第一列是基因名称，其余四列分别是control1，control2，rep1，rep2，从上表中可以很直观地看到每个基因的表达情况。

我们再来看看raw_count的最后5行，

tail (raw_count, n=5)

输出如下：

gene_id control1 control2 rep1 rep2
48821 __alignment_not_unique 11278964 14080481 18440618 14495860
48822 __ambiguous 295498 425708 498973 381237
48823 __no_feature 12642161 15042888 22357626 18675857
48824 __not_aligned 1025857 1067038 1675660 1529309
48825 __too_low_aQual 1107674 1303141 1799176 1542845

这5行（48821， 48822， 48823， 48824， 48825）没有匹配到相应的基因，需要删除，

raw_count_filt <- raw_count[-48821:-48825, ] # 删除5行，重新赋值给raw_count_filt

查看新矩阵raw_count_filt的最后5行，

tail (raw_count_filt, n=5)

可以看到，48821：48825已经被删除了，

gene_id control1 control2 rep1 rep2
48816 ENSMUSG00000110420.1 0 0 0 0
48817 ENSMUSG00000110421.1 0 0 0 1
48818 ENSMUSG00000110422.1 1 0 1 2
48819 ENSMUSG00000110423.1 0 0 0 0
48820 ENSMUSG00000110424.1 26 20 48 24

以行48820为例，第一列是基因名称ENSMUSG00000110424.1，但是这个名称在EBI数据库上是不能直接检索到的，只能是整数形式的ENSMUSG00000110424，因此，需要进一步替换为整数的形式，并且赋值给ENSEMBL。

ENSEMBL <- gsub("\\.\\d*", "", raw_count_filt$gene_id)
tail (ENSEMBL, n=5) # 查看ENSEMBL的最后5行

输出如下：

[1] "ENSMUSG00000110420" "ENSMUSG00000110421" "ENSMUSG00000110422"
[4] "ENSMUSG00000110423" "ENSMUSG00000110424"

ENSEMBL只有一列，即修改为整数的基因名称，下一步再将ENSEMBL添加到raw_count_filt矩阵:

row.names(raw_count_filt) <- ENSEMBL # 添加ENSENBL到raw_count_filt矩阵
tail (raw_count_filt, n=5) # 查看raw_count_filt的最后5行

gene_id control1 control2 rep1 rep2
ENSMUSG00000110420 ENSMUSG00000110420.1 0 0 0 0
ENSMUSG00000110421 ENSMUSG00000110421.1 0 0 0 1
ENSMUSG00000110422 ENSMUSG00000110422.1 1 0 1 2
ENSMUSG00000110423 ENSMUSG00000110423.1 0 0 0 0
ENSMUSG00000110424 ENSMUSG00000110424.1 26 20 48 24

[optional] 这一步选做，即把raw_count_filt矩阵的第二列删掉，并赋值给raw_count_filt2：

raw_count_filt2 <- raw_count_filt [ ,-1] # 删除raw_count_filt的第二列
tail (raw_count_filt2, n=5) # 查看raw_count_filt2最后5行

control1 control2 rep1 rep2
ENSMUSG00000110420 0 0 0 0
ENSMUSG00000110421 0 0 0 1
ENSMUSG00000110422 1 0 1 2
ENSMUSG00000110423 0 0 0 0
ENSMUSG00000110424 26 20 48 24

下面，我们就可以检查一些基因的表达情况了，比如GAPDH，首先，可以在uniprot或者Ensembl数据库中找到GAPDH对应的基因编号，即ENSMUSG00000057666，并将该基因编号赋值给GAPDH：

GAPDH <- raw_count_filt2 [rownames(raw_count_filt2)=="ENSMUSG00000057666",] # 赋值给GAPDH
GAPDH # 查看GAPDH表达情况

输出如下：

control1 control2 rep1 rep2
ENSMUSG00000057666 4136 4884 7200 4929

如要查询其他基因的表达情况，以此类推！

另外，我们也可以看一看所有基因的表达概况：

summary (raw-count_filt2)

control1 control2 rep1 rep2
Min. : 0.0 Min. : 0.0 Min. : 0.0 Min. : 0.0
1st Qu.: 0.0 1st Qu.: 0.0 1st Qu.: 0.0 1st Qu.: 0.0
Median : 0.0 Median : 0.0 Median : 1.0 Median : 1.0
Mean : 237.6 Mean : 290.6 Mean : 417.4 Mean : 342.2
3rd Qu.: 62.0 3rd Qu.: 65.0 3rd Qu.: 93.0 3rd Qu.: 71.0
Max. :108056.0 Max. :164091.0 Max. :171319.0 Max. :132792.0

如果想要把分析结果保存下来，则存储为.csv格式：

write.csv (x=raw_count_filt2, file="SRR35899.csv") # 保存raw_count_filt2矩阵为SRR35899.csv文件，保存位置在当前命令行目录中