单细胞测序-scRNA的测序基础
单细胞测序(single-cell sequencing)，顾名思义就是能从单个细胞中获取遗传信息的测序技术。单细胞测序技术为什么近来大火，那么它能帮科研工作者能解决哪些问题？单细胞测序技术原理和以及存在的问题有哪些？带着这些疑问，今天起跟随小编开启单细胞学习之路。
scRNA-seq 发展概述
单细胞转录组测序(single-cell RNA-seq)这项技术是由Tang et al.[1]在2009 年首次发表，但是由于测序的成本和当时有限的protocols，直到2014年scRNA-seq才得到广泛普及 [2]。近年来，随着单细胞测序技术的日渐成熟，以及以10x Genomics 为代表的生物公司将其商业化之后，这项技术也被愈来愈多的应用到生物学研究当中。今天小编给大家简单的介绍一下。
Scaling of scRNA-seq experiments; from Svensson, V. et al., [2].
scRNA-seq 优势
为什么我们要使用单细胞测序？它与传统的bulk sequencing相比具备哪些优势呢？
对于多细胞生物来说，细胞与细胞之间是有差异性的(cell heterogeneity)。这种差异性可以体现为不同的遗传背景，不同的分化状态，不同的物理特征 ，不同的基因突变谱和转录组、蛋白质组表达谱等 [3]。 这些差异可以帮助我们理解和研究不同细胞的临床生理表现。例如具有高度多样性肿瘤细胞。肿瘤在发生发展过程中，细胞持续产生新的突变而形成了许多亚细胞群，由于它们不同的免疫特性，生长速度以及转移能力等方面的差异，使得对药物或者放疗的临床反应有所不同。传统的研究中，大家往往根据细胞的物理形态或者marker genes来区分不同的细胞种类，对比之下单细胞测序则更加精确，大大的提高了细胞差异性研究的分辨率。
Picture taken from https://github.com/hbctraining/scRNA-seq [3].
针对转录组来说, 在传统的bulk RNA-seq 中，由于我们检测到的是是来自于多细胞的基因的平均表达， 自然就掩盖了细胞差异性的信号，特别对于一些来自罕见细胞亚群的信号就会被中和。
Taken from https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started [4].
而scRNA-seq的优势是它能够检测出这种差异性，提高了基因表达研究的分辨率， 因此它常被应用于以下几个方面 [5]：
1） 探索组织中存在哪些细胞类型或者亚群。
2） 识别未知或稀有的细胞类型或状态 。
3） 阐述在细胞分化过程 或者不同时间 (time-courses) 内基因表达变化。
4） 检测特定细胞亚群的差异表达；通过表达谱进行聚类，推断基因调控网络。
Common applications of single-cell RNA sequencing, from Trapnell et al., 2016 [5].
scRNA-seq 工作流程
当前scRNA-seq 的典型工作流程包括分离单细胞，提取RNA, 逆转录，扩增，构建文库和测序。早期的操作非常直接， 就是先将单个细胞逐个分离出来再分别进行建库，然而这种操作通量低且成本高。目前更常见的是将单个细胞包裹在微流体装置中的液滴中 (droplet-based)，在那里将mRNA转换为cDNA并扩增。
每个小滴都带有一个独一无二的DNA “barcode”， 标记了它来自哪一个单个细胞。除此之外， 也有protocols会采用唯一的分子标识符(umi)，对捕获的mRNA在扩增测序之前进行标记。一旦逆转录完成，就可以将来自许多细胞的cDNA混合在一起进行测序。
单细胞测序技术噪音
从流程中可以看到，实验操作还是很复杂的，这些实验技术带来的noise也使得下游的数据分析过程面临更多的挑战。在数据分析之前， 我们需要考虑一些常见的Technical noise 包括：
1） 细胞的完整性：在细胞分离和建库的过程中，可能会掺入死细胞，或者多个细胞被捕获在同一个液滴中（doublets or multiplets）。
2） 批次效应（batch effect）：类似于bulk RNA-seq, 细胞在被分组处理时，外在环境差异可能导致实验数据产生批次差异。
3） 对于droplet-based scRNA-seq，并不是所有的mRNA分子都能被捕获到， 并且由于测序深度比较浅， 一般来说每个细胞仅能检测到10～50%的转录本，这导致细胞中许多基因计数为0， 给之后分析工作增加了很大的计算负担。
小编总结
随着单细胞测序技术的不断成熟，此类数据会越来多，在高分期刊的发表也越来越常见。然而与传统的测序数据相比，单细胞数据分析则更加的复杂。之后我们会带大家了解典型的scRNA-seq 数据分析步骤，并进一步说明如何灵活的运用这些步骤，也可在V信"作图丫"获取同样精彩内容。
参考资料/文献
1. Tang, Fuchou, Catalin Barbacioru, Yangzhou Wang, Ellen Nordman, Clarence Lee, Nanlan Xu, Xiaohui Wang, et al. 2009. “mRNA-Seq Whole-Transcriptome Analysis of a Single Cell.” Nat Meth 6 (5): 377–82. https://doi.org/10.1038/nmeth.1315.
2. Svensson, V., Vento-Tormo, R. & Teichmann, S. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nat Protoc 13, 599–604 (2018)
3. https://github.com/hbctraining/scRNA-seq
4. https://www.10xgenomics.com/blog/single-cell-rna-seq-an-introductory-overview-and-tools-for-getting-started
5. Liu S and Trapnell C. Single-cell transcriptome sequencing: recent advances and remaining challenges [version 1; peer review: 2 approved]. F1000Research 2016, 5(F1000 Faculty Rev):182 (https://doi.org/10.12688/f1000research.7223.1)
6. https://en.wikipedia.org/wiki/Single_cell_sequencing
