Cellular protection using Flt3 a

本文选自2014年的nature  communication

摘要：谷氨酸诱导的氧化应激是神经退行性疾病的主要原因。在这里，我们确定了这一过程的小分子抑制剂。我们筛选了神经元细胞上的激酶抑制剂文库，并确定Flt3和PI3Ka抑制剂是抗谷氨酸毒性的有效保护者。这两种抑制剂都可以防止神经元细胞中活性氧的产生、线粒体超极化和脂质过氧化，但它们是通过不同的分子机制做到的。PI3Ka抑制剂通过诱导耗尽的谷胱甘肽水平的部分恢复和细胞内氨基酸的积累来保护细胞，而Flt3抑制剂防止脂质过氧化，脂质过氧化是谷氨酸盐介导的毒性的关键机制。我们还证明谷氨酸毒性包括铁死亡、坏死和AIF依赖的细胞凋亡。我们通过使用这些激酶的多种抑制剂和多种细胞类型来证实保护作用。我们的结果不仅确定了保护免受谷氨酸刺激的氧化应激的化合物，而且为神经元中谷氨酸毒性的机制提供了新的见解。

本文起始就说了一个问题就是谷氨酸介导的神经毒性，作者就想看看激酶抑制剂能否抑制谷氨酸毒性。然后通过文库筛选了两个可能的药物，进一步探讨了药物的机制。

谷氨酸通过增加TCA循环活性诱导谷胱甘肽耗竭和线粒体过度活化，从而提高活性氧水平并导致坏死细胞死亡。活性氧的产生可以促进铁催化的脂质过氧化，导致活性氧产生的第二次爆发和铁营养细胞的死亡。第二波活性氧的产生进一步损伤线粒体并引发凋亡，伴随着AIF从损伤的线粒体向细胞核的转移。Flt3抑制剂被认为可以防止活性氧的产生、脂质过氧化和随后的死亡级联反应，而PI3Ka抑制剂被认为可以通过部分恢复耗竭的谷胱甘肽水平来阻断活性氧产生的初始波。

作者应用了谷氨酸毒性经典的细胞模型——海马细胞HTT22.作者应用的氧化应激诱导是0.1%的缺氧。然后用抑制剂与谷氨酸存在的情况下孵育18小时，观察哪些可以保护细胞，找到了五种有效的抑制剂，对其中两种效果最好的进行了验证

这里E21和L13分别是Flt3抑制剂和PI3Ka抑制剂

紧接着，作者又观察了两种抑制剂对多种神经元暴露于谷氨酸条件下的保护效应，显示出E21在多种细胞中均有保护作用，但是L13在C6细胞中作用最明显，但是在SOD突变的神经细胞中反而具有促进死亡效应。作者进而验证了两种抑制剂是否真正对靶点发挥了作用，做了浓度梯度的WB实验

作者觉得可能仅用了这两种药物会存在未明确靶点所引起的这种抑制死亡效应，所以应用了多种PI3K和FLT3抑制剂，以此证明确实是这两个靶点影响了神经细胞氧化死亡的发生。尽管作用不尽相同，但是总体趋势和预期抑制，这个靶点作用显著，敲除后可以使抑制剂增敏。

既然细胞死亡可以被抑制，那么机制是什么，这里有两种抑制剂，可能涉及两种机制，在既要保证文章内容丰富的基础上，又不能太赘述，所以文章直接点明想要做的机制——就是想看看抑制剂对细胞各种死亡途径的影响。首先就是坏死----PI3k，先用FACS测HT22在谷氨酸诱导下ROS水平，发现存在两个高峰（6小时后，ROS水平增加，并且在孵育10小时后第二次爆发）

紧接着加上药物看看不同细胞系，展现出了E21功能强大，L13仅仅阻断了SOD突变细胞系的ROS生成（文中仅表述ROS总量，没有进行细分），同时发现谷氨酸可以引起脂质过氧化增强，抑制剂可以显著改善HT22细胞的脂质过氧化。因为ROS产生主要是线粒体产生的，作者测量了线粒体膜电位的改变。

其次，作者又进行测量了凋亡相关的指标。因为谷氨酸毒性表现为凋亡和坏死，显示出了凋亡的表型，但是没有检测出DNA断裂，有研究表明这些和AIF相关，作者进一步验证了抑制剂有AIF的关系。同时也验证了对caspase3/7的关系，E21抑制剂显著抑制了AIF的细胞核转移，但是L13并没有,并且在10小时以内是以坏死主，18个小时以凋亡为主。作者还发现L13以保护早期坏死为主，E21两者均起到保护作用。

紧接着，作者又进行了这种药物抑制死亡的时间依赖实验以及ATP的含量。两个药物均能够恢复ATP含量，在不同时间点加入抑制剂，抑制PI3Ka激酶活性会影响暴露于谷氨酸后不久发生的细胞死亡事件，而Flt3激酶抑制会影响细胞死亡途径中的早期和晚期事件。

最后，作者做了铁死亡。引用了两种铁死亡诱导剂erastin和BSO，首先验证一下计入不同铁是否会引起细胞死亡，用BSO抑制了细胞内GSH水平，在E21仍能够抑制铁死亡，但是L13效果较差，提示GSH对于L13发挥功能至关重要。

紧接着作者进一步研究了铁死亡中脂质过氧化的关键环节，花生四烯酸，通过添加花生四烯酸看看对抑制剂的作用影响。显然E21的作用没有受到影响，反而L13的作用受到影响。说明E21发挥作用应该在抑制脂质过氧化及下游阶段。谷氨酸代谢需要经过三羧酸循环，作者看了看抑制TCA循环对谷氨酸的利用是否会改善谷氨酸毒性。观察到AOA(1-2mM)从谷氨酸介导的细胞死亡中拯救了HT22细胞，这表明谷氨酸可能有助于脂质的合成，最终促进谷氨酸诱导的细胞死亡，或者TCA活性可能直接有助于活性氧的产生

作者做了代谢相关的分析-氨基酸水平变化。使用1H-核磁共振代谢组学方法来表征氧化谷氨酸毒性所涉及的代谢变化。一波生信分析。受L13显著影响的一种代谢物是谷胱甘肽，其通过谷氨酸盐处理显著降低，但通过添加L13也显著挽救，用谷氨酸盐处理后8小时，氧化的谷胱甘肽总量完全耗尽，但通过添加L13而不是E21，谷胱甘肽总量部分和显著恢复。作者又做了脂质组学的核磁质朴，用谷氨酸盐处理时，游离多不饱和脂肪酸的水平降低，但通过E21处理完全恢复

本文的亮点可能就是证明了AIF参与了铁死亡的过程，为以后FSP-1的发现提供了参照。