Regulation of Ferroptotic Cancer
本选自cell 2013年老文章
摘要：铁死亡是一种非凋亡细胞死亡形式，其关键调节因子尚不清楚。我们为12种诱发铁死亡的小分子的致死性寻找一种共同的介质。我们使用靶向代谢组学分析发现，谷胱甘肽的耗竭导致谷胱甘肽过氧化物酶(GPXs)对一类化合物的失活，而chemoproteomics strategy发现GPX4被第二类化合物直接抑制。GPX4过表达和敲除调节了12种铁死亡诱导剂的致死性，但没有调节11种具有其他致死机制的化合物的致死性。此外，在异种移植小鼠肿瘤模型中，两种代表性的铁死亡诱导剂可阻止肿瘤生长。177个癌细胞系的敏感性分析揭示了扩散性大细胞淋巴瘤和嗜酸性细胞癌对GPX4调节的铁死亡特别敏感。因此，GPX4是铁敏感性癌细胞死亡的重要调节因子。
选择性调节细胞死亡机制的激活可能有利于治疗疾病，如癌症，其中凋亡细胞死亡机制由于遗传改变而被抑制。事实上，替代细胞死亡途径的激活可以克服与现有化疗药物相关的耐药性，提供新的药物靶点。
我们最初关注的是erastin和RSL3。Erastin通过调节VDAC2/VDAC3和系统xc重新编程癌细胞代谢来触发铁死亡，而RSL3诱导的铁死亡不依赖于这些因素，但导致类似的下游细胞死亡表型。因此，我们认为erastin和RSL3是阐明铁死亡保守下游调控因子的理想探针。然后分别用两个要去处理肿瘤细胞，发现两者之间的共同枢纽就是GPX4.cell文章就是大气，就是敢这么说。
一起看看结果
首先作者用erastin诱导骨肉瘤细胞进行脂代谢产物检测，发现还原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)在erastin治疗后都显著减少，而溶血磷脂酰胆碱(lysoPCs)水平增加。然后，作者在多个细胞系进行了验证，得到一致结论，发现erastin对谷胱甘肽的消耗是致死的必要条件，补充GSH可以预防死亡。作者构建了erastin的类似物，发现三种化合物(MEII、PE和AE)保留了选择性致死性，而三种化合物(A8、PYR和dMK)则没有致死性。显然，这种致死性也是通过调节GSH实现的 。
既然GSH是erastin诱导铁死亡的关键，那么，通过消耗谷胱甘肽可能模拟了erastin的致死效应，（通过对BJ细胞ras突变筛选药物时发现的erastin），表明谷胱甘肽耗竭足以诱导致癌的HRAS过度表达的BJ细胞的铁死亡，这些结果表明，erastin通过抑制系统xc，阻止胱氨酸的摄取而使谷胱甘肽耗竭。
鉴于我们发现谷胱甘肽耗竭对erastin诱导的铁死亡至关重要，我们研究了伊拉斯汀对谷胱甘肽的耗竭是如何在BJ细胞系中诱导选择性致死的。据推测，大多数癌细胞，包括RAS转化的成纤维细胞，处于高水平的氧化应激下，因此需要通过增加ROS清除能力来抵消，以防止氧化损伤。在这个模型中，通过多点靶向活性氧清除系统，包括谷胱甘肽耗竭，将导致这种平衡失衡，导致氧化细胞死亡。这里是作者的假设。作者应用ROS检测试剂去检测BJ细胞的ROS水平，用一种超氧化物歧化酶抑制剂(DETC)、一种巯基反应试剂(迪亚)、一种硫氧还蛋白还原酶抑制剂(DCNB)或一种过氧化氢酶抑制剂(ATZ)处理这四种BJ来源的细胞系，这些抗氧化剂抑制剂中的三种(DETC、狄亚和DCNB)杀死了BJ来源的细胞。这里作者用了2倍和4倍的IC50药物浓度处理细胞，然后发现GSH清除对肿瘤有选择性，但是非GSH清除的没有这种选择性。所以说仅通过抑制抗氧化网络并不能选择性诱导铁死亡。反而更加说明了谷胱甘肽耗竭才是选择性诱导铁死亡的原因。作者检测了不同药物处理后脂质ROS水平，只有erastin和BSO 处理后脂质ROS 才明显升高。这表明在致癌的含HRAS细胞系中，细胞溶质和脂质ROS水平都通过去谷胱甘肽选择性地增加
因此，作者认为谷胱甘肽耗竭的一个后果可能是谷胱甘肽依赖性过氧化物酶的失活。谷胱甘肽是GPX酶活性的主要辅因子，谷胱甘肽过氧化物酶催化过氧化氢和有机氢过氧化物还原成水或相应的醇，利用谷胱甘肽作为必要的辅因子（NADPH的减少量和谷胱甘肽过氧化物酶的活力线性相关。）,可见，在GSH清除治疗中GPX4的活性是降低的（这也可能间接反映了为什么铁死亡诱导过程中GPX4是升高的原因了）
紧接着，作者把目光瞄向了另一个铁死亡的诱导剂RSL3，这个作用和erastin靶点不一致，所以，可能通过对两者的机制研究发现铁死亡共同的通路。结果发现了脂质过氧化是铁死亡的共同过程。
在BJ细胞系统中，只有(1S，3R)-RSL3的RSL3非对映体显示出选择性致死性。
作者用铁死亡诱导后进行质谱分析，有趣的是，GPX4被确定为我们寻找RSL3靶蛋白的无偏化学蛋白质组学方法中排名最高的候选蛋白，因为erastin通过谷胱甘肽耗竭抑制细胞GPX酶。紧接着作者又研究了在RSL3处理后的GPX4活性，发现GPX4活性收到了抑制如图i（这里用到了类似于体外酶解的方法检测的，引用于参考文献）。
通过前面得出了GPX4在这个过程的重要意义，作者紧接着用了RNAi敲掉GPX4然后观察铁死亡的表型变化。然后加入铁死亡抑制剂可以挽救这一过程（u0126，VE,DFOM）。Sideath是一种针对多个必需基因的对照siRNA池，突出了这些抑制剂的铁下垂特异性作用。这些数据表明GPX4是RSL3的主要靶标，介导其在致癌的含HRAS的BJ衍生的成纤维细胞中诱导铁死亡的能力。
GPX4敲除对BJeLR细胞是最致命的，与其他GPX酶相比，这突出了GPX4抑制在诱导细胞死亡中的突出作用。
作者对小分子抑制剂的筛选，进一步确定了GPX4在诱导铁死亡过程中的普遍性及枢纽性作用。
作者又在体内试验中验证了诱导铁死亡对于肿瘤的治疗作用。首先为了能够表征铁死亡，作者进行了铁死亡标志的一个筛选，这里发现了PTGS2.但是吲哚美辛治疗不影响铁死亡过程，提示PTGS2是铁死亡的一个下游标志。
因为erastin难溶的特性，作者构建了一个容易溶解的erastin称为PE，通过诱导发现PE和RSL3可以在诱导铁死亡过程中升高，并且具有相对特异性。使用siRNAs敲除GPX4显著增加了PTGS2的基因丰度，而siDeath对PTGS2的基因丰度的影响最小(图6B)。熊谷等人(2004)报道了4-HNE对PTGS2的上调，4-HNE是氧化脂质的终产物。此外，从Gpx4缺陷小鼠获得的皮肤组织样本中的基因表达的DNA微阵列分析确定Ptgs2是由于Gpx4缺失而上调的关键基因(Sengupta等人，2013)。综上所述，这些数据证实PTGS2上调是GPX4调节的铁下垂期间发生的脂质过氧化的合适标记。
然后，作者就中了皮下瘤，检测了肿瘤生长及PTGS2的表达情况。不管肝脏中的铁死亡激活情况如何，我们在两项动物研究中都没有观察到明显的毒性，这是通过缺乏急性致死性和缺乏显著的体重减轻来评估的。（这也是目前铁死亡体内研究中的一个盲点）。NCI的发育治疗计划(DTP)在体内评估了腹膜内注射(1S，3R)-RSL3的毒性，并且没有观察到高达400毫克/千克剂量的毒性，这表明这些剂量的(1S，3R)-RSL3具有良好的耐受性
小鼠皮下注射BJeLR细胞，1天后在同一部位注射100 mg/kg
(1S，3R)-RSL3。(1S，3R)-RSL3注射每周重复两次，持续2周。三周后，我们在(1S，3R)-RSL3处理的动物中观察到显著的肿瘤生长预防作用(图6C；p
= 0.0053)。随后，我们在一项治疗研究中检测了(1S，3R)-RSL3缩小原有肿瘤的能力，使用允许生长1周的s.c
.异种移植肿瘤，然后用100毫克/千克(1S，3R)RSL3每周两次治疗2周。
这个药物时经肝代谢吗？为什么检测了肝的药物残留和PTGS2
作者最后检测了RAS突变状态与原则性铁死亡诱导的相关性，评估是否可以依靠RAS突变状态的选择致死性。但是，在RAS突变的癌细胞系中没有显示出超过RAS野生型对应细胞的选择性致死性。这是否也说明了在多种肿瘤细胞中铁死亡的应用可行性，并非仅限于RAS突变的肿瘤基因背景。在一项较大的药物筛选分析中，观察到悬浮细胞系通常对小分子的生长抑制作用更敏感。作者就对多种悬浮细胞进行了检测。发现弥漫大B淋巴瘤对铁死亡诱导特别敏感。
作者检测了铁死亡诱导后的脂质过氧化水平，发现明显升高，对多种细胞系进行铁死亡敏感性检测，发现肾癌对铁死亡诱导也非常敏感，使用siRNAs敲除GPX4降低了GPX4蛋白的水平，足以杀死这些肾细胞癌细胞系。
本文结束，这是第一篇关于肿瘤的铁死亡文章，也是第一次阐明GPX4抑制和XCT抑制通路诱导铁死亡的机制。
