科普讲堂|什么是单细胞测序？

简介

单细胞测序技术，简单来说，就是在单个细胞水平上，对基因组、转录组及表观基因组水平进行测序分析的技术。传统的测序，是在多细胞基础上进行的，实际上得到的是一堆细胞中信号的均值，丢失了细胞异质性（细胞之间的差异）的信息。而单细胞测序技术能够检出混杂样品测序所无法得到的异质性信息，从而很好的解决了这一问题。

图1 单细胞转录组测序示意图

单细胞测序技术自从2009年首次问世，在这十几年以来持续不断地发展。尤其是近几年，单细胞测序出现了爆发式的发展和普及。2011年，《Nature Methods》杂志将单细胞研究方法列为未来几年最值得关注的技术领域之一。2013年，《Science》杂志将单细胞测序列为年度最值得关注的六大领域榜首，《Nature Methods》杂志将单细胞测序的应用列为2013年年度最重要的方法学进展。2017年10月16日，与 “人类基因组计划” 相媲美的 “人类细胞图谱计划” 首批拟资助的38个项目正式公布，引爆单细胞测序新时代。

单细胞表达谱测序与bulk RNA测序对比

传统的二代测序中，最为人熟知的就要数RNA-seq了（图2）。RNA-seq是提取组织、器官或一群细胞的混合RNA(bulk RNA)进行测序，能够得到的是一群细胞的转录组的平均数据，细胞群体中单个细胞的特异性信息往往被掩盖（比如特异表达的基因或RNA不同的剪接体）。而随着对生物结构功能的深入研究，人们越来越清楚地认识到，哪怕看似相同的细胞群，细胞之间的转录组表达水平也是存在差异的。以肿瘤为例，肿瘤中心的细胞，肿块边缘的细胞和肿块周围的细胞，乃至远端转移的细胞，其转录组等遗传信息一定是存在差异的，而传统的研究手段通常将整个肿块整体进行研究，或者将肿块简单分区分割，得到每一部分细胞基因表达的平均值，丢失了每个细胞的异质性信息，使科研人员对肿瘤微环境中各种细胞转录组表达及免疫功能的理解和认识始终无法深入。

图2 Bulk RNA-Seq示意图

由此可见，为了得到原始和真实的细胞遗传信息，对转录组的分析须在单细胞水平上展开。单细胞表达谱测序技术可以从混杂组织中捕获单个细胞，并能从中够获取单个细胞的表达信息，检测出混杂样品中细胞的异质性数据。目前单细胞的捕获策略大体分两种：

· 早期的单细胞捕获方式

早期的单细胞获取方式，是通过一定的技术手段，将单个细胞分离出来，并利用SMART-Seq2或商业化的SMART-Seq4试剂独立构建测序文库，最终进行测序。捕获方式包括：有限稀释法，流式分选法，激光切割法，显微操作法（图3前四种）。这些方法虽然各有各的优点，但各自的缺点也十分明显，比如流式分选法对于难度的计算易存在误差；流式分选法不适用于微量样本；激光切割法操作复杂；显微切割法的细胞通量低等。而它们的共同缺点，就是捕获成本高。

图3 单个细胞的主要分选方式

· 使用微流控技术获取单细胞

通过微流控芯片将单个细胞捕获至油滴（图3最后一种），就是微流控技术。这种方式的优点是细胞通量高，周期快速，成本低，细胞捕获效率高，并且商业化仪器操作简便。其核心思想是将不同的细胞赋予一段不同的barcode序列，建库时，携带相同barcode序列的核酸分子被认为来自同一个细胞，人们就可以一次性为成百上千的细胞建库并顺利区分它们。

图4 10X Genomics Chromium单细胞检测平台

以目前占全球95%市场份额的10X Genomics Chromium转录组测序为例，细胞与逆转录试剂预混在一起，通过微流控芯片的一条通道，与另一通道中的携带百万个不同标签（barcode）的凝胶珠（gel beads）相遇，穿过油幕的同时被包裹在一个油滴中，便可以轻松得到一个细胞和一个凝胶珠包在一起的油包水滴GEMs（图4）。

图5 油包水滴GEMs形成过程

对于3’单细胞转录组来说，每一个凝胶珠携带足量条的核酸链，而每条核酸链由read1 primer，细胞标签（barcode），分子标记（UMI），poly(dT)组成。一个凝胶珠上所有的核酸链的细胞标签（barcode）是相同的序列，而不同于其他凝胶珠上的细胞标签（barcode），用于标记细胞。一个凝胶珠上所有的核酸链的分子标记（UMI）是不同的，用于标记不同的RNA序列（图5）。

图6 凝胶珠的结构示意图

逆转录在油包水隔离的小室中进行，细胞破裂释放出mRNA，其3’端poly(A)序列被凝胶珠上的poly(dT)捕获。这样，同一个细胞的mRNA带有同一个细胞标签（barcode），可以与别的细胞的mRNA区分开；每条mRNA带有不同的分子标记（UMI），可以用来计算不同基因转录本的拷贝数，避免PCR扩增偏差（图6）。之后，对单个样本进行cDNA回收、建库和测序，分析测序下机数据识别barcode，得到单个细胞的表达矩阵、分群等信息。

图7 10X Genomics如何区分单细胞

由于这种单细胞检测平台的出现和商业化，使得单细胞测序技术的使用门槛大大降低，不仅实现了细胞通量（实际测到的细胞数量）的飞跃，而且大幅降低了单个细胞的检测成本。

单细胞测序的应用

单细胞测序技术，是在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析的一项新技术。它能够揭示单个细胞的基因结构和基因表达状态，反映细胞间的异质性，在肿瘤、发育生物学、微生物学、神经科学等领域发挥重要作用，正成为生命科学研究的焦点。

图8 单细胞测序技术的相关应用

随着精准治疗时代的到来，未来单细胞技术，将会有助于人类的科学研究以及临床应用，尤其是在肿瘤、微生物、神经科学、免疫学等领域，应用会越来越广泛。

· 肿瘤研究上的应用

2021年6月15日，Cell杂志发表了一篇通过单细胞分析探测肿瘤的血管选定研究的文章。该研究采用了单细胞转录组测序技术(scRNA-seq)，对31964个具有AAT（抗血管生成）抗性小鼠的肺肿瘤血管内皮细胞（TECs）和周细胞进行了检测。结果显示实验组与健康对照组的TECs和周细胞的表达谱都非常相似。同时还发现基质重塑巨噬细胞有助于浸润性癌细胞的血管选定；M1样巨噬细胞亚型可使血管细胞保持静止。

图9 肺肿瘤模型ECs的scRNA-Seq

该研究重在体现对抗VEGF（血管内皮生长因子） 阻断 AAT时，肿瘤血管选定的临床重要性，而且有助于确定肿瘤血管的细胞表型，从而在研究抑制肿瘤新生血管生成，抑制肿瘤细胞的生长和转移的道路上向前迈进了一大步。

· 新冠治疗研究中的应用

2020年7月，北京大学谢晓亮团队在Cell上发表了一篇关于新冠病毒特效药的文章。此项目首先从60名新冠康复病人的血液中分离出B细胞，利用单细胞转录组+单细胞BCR测序技术对这些B细胞进行检测，筛选出8558种病毒蛋白结合抗体序列，并找出14株高活性的中和抗体。之后进行小鼠实验，最终成功筛选出一种非常有效的中和抗体BD-368-2。经实验证实，此中和抗体可以大幅度提升新冠治愈率，缩短治愈时间，甚至可以提供短期的病毒免疫，在治疗和预防方面都发挥重要作用。

图10 通过富含抗原的高通量单细胞RNA测序进行有效的中和抗体鉴定

· 阿尔兹海默症研究中的应用

2019年5月,Nature报道，通过对24名阿尔茨海默病人和24名正常人尸检大脑样本的8万个细胞进行单细胞转录组测序。研究不仅分析出兴奋性和抑制性神经元，还分析稀有的非神经元脑细胞，如少突胶质细胞、星形胶质细胞和小胶质细胞。这些细胞类型中的每一种在阿尔茨海默病患者中都表现出明显的基因表达差异。其中，轴突再生和髓鞘形成相关的基因在阿尔茨海默症中表现出明显差异。

图11 单细胞测序对阿尔兹海默症病人的研究及结果分析

单细胞测序的未来

目前，全球潜在科研市场体量已经达到130亿美元以上，单细胞测序技术的市场更以年均20%以上的速度逐年增长。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔。随着测序技术的发展和测序水平的提高，单细胞测序技术能够解析细胞间更加细微的差异，正在推动癌症及肿瘤研究、发育生物学、微生物学研究、免疫、以及神经科学领域向前发展，并逐渐成为生命科学研究的焦点。

图12 单细胞测序技术在未来应用会越来越广泛

如今，单细胞测序正如火如荼，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解转录组、免疫组和表观组的多样性。我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进！