Week26 — 人类原发性肿瘤的染色质可及性图谱-03

Week24 — 人类原发性肿瘤的染色质可及性图谱-01: 主要回顾了ATAC-seq方法的原理和优点，并与其他研究染色质可及性方法的比较，然后介绍了这篇文章的主要结果和亮点以及提供的数据资源。
Week25 — 人类原发性肿瘤的染色质可及性图谱-02：介绍了文章思路和主要结果。
这篇文章主要了解下补充材料的分析方法。

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1. ATAC-seq数据预处理和比对

ATAC-seq预处理和比对使用的是PEPATAC pipeline(http://code.databio.org/PEPATAC/)。
PEPATAC pipeline是一个打包的ATAC-seq数据预处理流程，包括对原始数据的去接头、比对、call peak、创建bigwig、TSS富集文件等其他一些统计结果文件。
输出的图如：

具体包括：

• Bowtie2 比对，移除比对到chrM和重复序列

-k 1 -D 20 -R 3 -N 1 -L 20 -i S,1,0.50 -X 2000 –rg-id # remove repeats的参数
--very-sensitive -X 2000 --rg-id # bowtie2参数

• 排序去除重复
  使用Picard 的MarkDuplicates去除重复。

-f 2 -q 10 -b -@ 20 # 排序参数
VALIDATION_STRINGENCY =LENIENT REMOVE_DUPLICATES = true #去重参数

2. call peaks(MACS2)

这里他们选用固定宽度（fixed-width）的peaks,优点有：1）对大量的peaks进行counts和motif分析时可以减小误差；2）对于大量数据集的可以合并峰得到一致性的peaks;
使用的是macs2 call peaks,参数如下：

--shift -75 --extsize 150 --nomodel --call-summits --nolambda --keep-dup all -p 0.01

同时根据hg38 blacklist过滤，并除去染色体两端以外的峰。
一个样本的overlaps他们是通过迭代移除的方法，首先保留最显著的peak,然后任何与最显著peak有直接overlap的peaks都被移除；接着对另一个最显著性的peak进行相同的操作，最终保留所有更显著的peaks，移除与其有直接overlaps的peaks。

3. ATAC-seq数据分析—— 构建counts矩阵并标准化

为了获得每个峰中独立的Tn5插入的数量，首先用RRsamtools “scanbam”对BAM文件矫正Tn5偏移量（“+” stranded +4 bp, “-” stranded -5 bp）并存入Genomic Ranges对象。然后用“countOverlaps”对矫正后的插入位点计数，最终得到 562,709 x 796 counts 矩阵。
counts矩阵用edgeR “cpm(matrix , log = TRUE,prior.count = 5)”标准化，然后用R中的preprocessCore’s “normalize.quantiles”做分位数标准化。

4. ATAC-seq data analysis – Transcription factor footprinting

TF足迹的分析：
一是参考了文章doi: 10.1016/j.celrep.2017.05.003：

• 首先确定peaks内的TF motif的位置，用pan-cancer peak set 结合CIS-BP motifs计算motif的位置，motifmatchr “matchMotifs(positions = “out”)
• 然后计算flanking accessibility 和 footprint depth
• 最后确定哪个TF的足迹与基因的表达是显著相关
  通过将flanking accessibility or footprint depth与250个随机的TFs的关联分析生成零均值和标准偏差。

5. ATAC-seq data analysis – chromVAR for transcription factor activity

除了足迹分析，他们还用chromVAR包评估TF的活动，首先用chromVAR deviations函数计算GC矫正偏差，然后将矫正偏差与motif相关的TFs关联，最后5000个转录因子基序和非相关转录因子基因的RNA-seq基因表达之间的随机相关性，以计算每个相关性的FDR。具体参考：Week4— chromVAR:预测染色质可及性相关的转录因子

6. ATAC-seq data analysis – chromVAR for GWAS enrichment

• 首先从GWAS catalog（https://www.ebi.ac.uk/gwas/docs/file-downloads）下载SNPs位点，过滤和16种癌症类型相关的SNPs位点。
• 加上连锁不平衡（Linkage Disequilibrium ，LD) 信息（ r 2 > 0.8）
  LD信息从haploreg 网站下载 http://archive.broadinstitute.org/mammals/haploreg/data/
• 移走位于exons或UTR区域的SNPs位点，得到最后的SNP列表
• 将最后的SNP列表与远端 binarization peak 集overlap，得到一个二元匹配矩阵。每列代表不同癌症癌症类型的GWAS SNP，每行代表一个peak，这个peak来自远端 binarization peak 集。
• 用chromVAR deviations函数计算GC矫正偏差
• 用PNAMER将“偏差分数”转换为p值，并使用Bejimi-HocHBG程序调整