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病毒包装-慢病毒

2021-09-19  本文已影响0人  期待未来
不同病毒比较 维真生物官网-慢病毒包装3k以上的基因组已经比较困难
LV-ADV-AAV比较

慢病毒包装

逆转路病毒分离-慢病毒 图 1. 简单和复杂逆转录病毒粒子结构。病毒颗粒含有两份正链RNA,RNA上附有反转录酶(RT),它们位于病毒的内核。除此之外,内核还包含核壳(NC)、衣壳(CA)、整合酶(IN)和蛋白酶(PR)。内核由一圈基质蛋白(MA)所包围,基质蛋白又被来源于宿主细胞细胞膜插有包膜糖蛋白(ENV)的腹膜所包围。

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图 3. 逆转录病毒的复制。感染始于病毒的Env蛋白与细胞表面受体相互作用,然后进入细胞。RNA基因组由RT反转录为双链DNA,然后入核,在IN的作用下整合至宿主基因组内。新合成的病毒蛋白和病毒基因组RNA积累一段时间后,这些组成部分被包装成一个个病毒颗粒,以出芽的方式离开细胞,获得了一层来源于细胞的膜。当Gag和Gag-Pol多聚蛋白被病毒蛋白酶切割后,病毒颗粒成熟。 图 5. 慢病毒质粒。很多的慢病毒系统使用一个转运质粒和两个辅助质粒。它们的特征在文中已有详尽的描述。更新的系统也许会使用三个辅助质粒,其中rev基因编码在一个单独的质粒上。通过进一步阻止重组事件的发生,阻止能自我复制的病毒的产生,这被认为能改进安全性。

在程序上,慢病毒和逆转录病毒载体的一个重要区别在于:对慢病毒载体,通常包装、包膜和转运质粒共转染入包装细胞系,而对逆转录病毒载体,只有转运载体才转染到细胞系内,而细胞系早已稳定表达另外两种载体.

包膜蛋白
病毒载体可以借助其他病原体的外壳蛋白包装成假病毒,以改变其嗜性。最常用的是疱疹性口腔炎病毒膜融合包膜G糖蛋白(VSV-G) 。其他常见的包膜蛋白来源于狂犬病毒、鼠白血病病毒、埃博拉病毒、杆状病毒、麻疹病毒和纤丝病毒。杆状病毒GP64和肝炎E1和E2型假病毒增强肝转导,纤丝病毒包膜型假病毒增强呼吸道上皮细胞或内皮细胞的转导。有趣的是,假病毒还会影响狂犬病毒糖蛋白包被的慢病毒的运输,导致轴突逆行运输 [12] 。

注意:由于γ-逆转录病毒和慢病毒gag、pol和env基因间的亚型差异,转运质粒和包装质粒不能够互换。
该系统中还增加了两个元件,分别为来源于旱獭肝炎病毒的转录后调控元件(Woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulation element, WPRE)和来源于HIV1整合酶基因的central Polypurine Tract(cPPT),WPRE有利于增加蛋白的表达量,而cPPT元件则有利于增加病毒的滴度,WPRE和cPPT元件能使蛋白的表达量至少提高4倍。

慢病毒颗粒的生产和转导 慢病毒包装载体

助转染试剂:(Ploybrene的选择)

Ploybrene是带正电的小分子,与细胞表面的阴离子结合,提高慢病毒对细胞的感染效率,通常加入polybrene感染效率可以提高2-10倍。Polybrene有一定的细毒性,有的细胞对polybrene的毒理反应明显,因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索;不同细胞对polybrene的敏感度不同,可以用1-10ug/ml的范围筛选合适的浓度,以24h内细胞武鸣县毒性反应为最佳,可参考文献并进行预实验摸索,polybrene最常用的工作浓度6-8ug/ml。

参考:https://www.addgene.org/viral-vectors/lentivirus/lenti-guide/

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