DNA甲基化—肿瘤早筛

蜜蜂在出生时候都一样，但是吃食蜂王浆的最后变成了蜂王，没有吃食则成了工蜂；同卵双胞胎基因组相同，但依然会显示出肉眼可见的差异；睡眠不足会导致人类基因组中DNA甲基化的水平产生变化， 这种表观遗传的印记还可能传递给我们的后代。这些现象都是如何解释呢？

我们都知道通过中心法则，有的基因可以表达有的基因表达则不表达，而表观遗传可能决定着这些基因的表达方式表达时间等。 表观遗传学可以定义为研究基因表达的可遗传变化，这种变化独立于原始DNA序列的变化，会受环境等因素的影响而发生改变。基因表达的表观遗传调控是由DNA甲基化、组蛋白修饰等机制介导。

DNA甲基化是哺乳动物中研究最深入的表观遗传修饰之一。1983年，Feinberg 与Vogelstein发现肠癌组织中特定基因的甲基化水平降低，同年，Gama-Sosa等人证实肿瘤样品中5-甲基胞嘧啶的减少，自此科学界开始广泛研究甲基化与癌症的关系，并取得了很多突破性的进展。

在正常细胞中，DNA甲基化拥有调节基因表达和沉默的重要作用。动物基因组中，甲基化主要发生在CG位点上，是一种共价修饰方式，DNA复制后，硫-腺苷-L-蛋氨酸（S-adenosylmethionine）通过酶反应把-CH3基团添加到基因组胞嘧啶上。哺乳动物中，基因组中约60%-90%的CpG核酸位点DNA甲基化，在真核生物DNA中,5-甲基胞嘧啶是唯一存在的化学性修饰碱基，通常情况，未甲基化的CpG成簇地组成CpG岛,位于结构基因启动子的核心序列和转录起始点，人类大约有 30 亿个碱基对，基因组中大约有 2800 万个 CpG 位点。

通过以上对DNA甲基化的表述不难看出DNA修饰在转录调节中起着关键作用，因此这一机制的缺陷可能导致包括癌症在内的各种疾病也就不足为奇了。在癌症发生时，抑癌基因启动子区域表现为高甲基化，基因启动子甲基化以后基因表达就会减弱甚至关闭。恶性肿瘤中大多数基因的开关由DNA甲基化调控，几乎所有肿瘤发生时都会伴随DNA甲基化的异常发生，通常情况下高甲基化与低甲基化并存。如肿瘤细胞中抑癌基因启动子通常为高甲基化，抑制抑癌基因表达使其丧失抑癌功能，从而促进癌症的发生。而低甲基化则通常是整个基因组低甲基化或原癌基因启动子的低甲基化，前者染色体结构稳定性降低，导致癌变发生，后者则激活原癌基因，诱导细胞癌变。在肿瘤细胞中，基因组整体甲基化水平降低至 20~50%，与正常细胞相比，约有 10~60% 的 CpG 位点甲基化状态发生了改变。  

2020年全球新诊断癌症1930万例，其中癌症死亡人数为1000万人。这意味着什么呢？意味着全世界1/5的男性和1/6的女性会在一生中的某一时刻患上癌症，其中1/8的男性和1/11的女性将死于癌症。

全世界范围内，前五名的癌症是乳腺癌，肺癌，结直肠癌，前列腺癌，胃癌，而最引人注目的一点莫过于乳腺癌!在所有癌症发病占比中，乳腺癌首次超越肺癌站上了冠军的位置。

早在2018年的统计报告中，癌症所致死亡在中国还屈居第二，而来到2020年，中国人的死亡原因排名中癌症已经跃居第一。

随着人类对抗癌症的严峻形势，肿瘤早筛的市场应运而生，甲基化几乎发生在所有的肿瘤当中，所以针对于不同肿瘤靶点的甲基化试剂盒受到了广泛关注，其中肠癌因其具有明确的早筛临床意义，以及相对成熟的技术路径，相对其他癌种的早筛产品走的更快，也为降低肠癌的死亡率做出了很重要的贡献。

2014年，Exact Sciences结合多学科原理，建立了多靶点粪便DNA检测方法，推出了Cologuard，用于肠癌筛查并获得了FDA审批。包括7个DNA点突变位点（KRAS），以及2个DNA甲基化位点（NDRG4和BMP3）2017年以来，我国也有近十个甲基化试剂盒面向市面，涵盖肠癌、胃癌等癌种，肠癌的早筛试剂盒因其检测样本获取简单，样本无需复杂处理，操作便利，准确快速，无侵入创伤性，成为早期结直肠癌很有前景的筛查方法之一。小编搜索数据发现，目前在注册阶段的甲基化试剂盒有几十个。2021年，北京市率先将甲基化检测纳入医保范畴，足见甲基化试剂盒的研发前景广阔。DNA甲基化标记物被认为是一种预测因素。它们不仅可用于早期疾病的筛查，还可用于确定个体对化疗的反应。此外，在治疗或治疗性手术后监测DNA甲基化谱可能可以给治疗有效性的评估和检测疾病复发提供证据。

基于此，甲基化试剂盒的研发已经成为各大IVD企业争相开发的模块，而在甲基化研发阶段，获得稳定的阳性和阴性对照至关重要，早期使用体外构建质粒或亚硫酸盐转化的 DNA作为企业参考品已经逐渐退出甲基化试剂盒研发的舞台，若使用来自临床的样本作为对照又受限于该标准品的不稳定和难获取的特性。所以寻找稳定的甲基化/非甲基化细胞株以及构建去甲基化/甲基化细胞株成为企业较为倾向的对照品，来源于细胞株的对照品可以实现稳定的供应，且成本较低。

说到基因编辑细胞，CRISPR技术在基因编辑细胞的工作中大放异彩，不仅有Cas9对基因的特定编辑，Cas9的核酸酶发生双突变后可以产生“钝化”和“死亡”Cas9，即“dCas9”，这种核酸酶失去切割DNA的功能，但在gRNA的指导下仍能以相同的精确度靶向和结合DNA。切割失活的Cas9连上转录抑制和激活元件，可以达到基因组特定位点的修饰， dCas9蛋白可以与效应器阻遏（如蛋白和激活剂结构域）形成融合蛋白，这样，dCas9可以将这些效应器带到启动子区域、调控区域或编码区域，对任何基因进行精确定点调控而不造成DNA损伤, 如结合TET1（DNA甲基化羟化酶）可以特异性催化DNA的去甲基化，从而调节基因的表达.

海星生物利用CRISPR技术可以对特定基因的甲基化进行编辑，此外也可以构建去甲基化的广泛使用细胞株，海星生物也致力于建立细胞平台，整合甲基化细胞株，助力甲基化试剂盒研发。 

参考文献：Kulis M, Esteller M. DNA methylation and cancer. Adv Genet. 2010;70:27-56. doi: 10.1016/B978-0-12-380866-0.60002-2. PMID: 20920744.