CRISPR-Cas9基因编辑4--确定Cas9质粒构建成功+漂
简介和前期文章
我对之前的所有教程进行了再次详细的总结
CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计（上）
CRISPR-Cas9基因编辑之gRNA设计（下）
CRISPR-Cas9基因编辑3--sgRNA-Cas9质粒构建
前言：
在上一篇文章中我们使用Golden Gate assembly（好奇这是什么的话，可以去谷歌哦）的方法完成了sgRNA-Cas9质粒的构建，在简书上有收到评论说使用T4 PNK做sgRNA失败但找不到原因。师兄DZ根据张峰组protocol调整后的质粒构建方法，我们从来没有做失败过，突然深感课题组里面有老司机的重要性，而有时候我们稀疏平常的操作，其实是前人花费大量时间摸索的结果，因此我决定把方案写得更细一些，希望以后依样画葫芦就能做出来。
实验正文--酶切确认质粒构建成功与否~ 2-3 h
这是一个很简单的实验，但当我是一个分子克隆零基础的小白的时候，我连酶切是什么都不清楚。因此我认为，就像学习生物信息学一样，阻挡大家学习的不是没有代码，而是看不懂代码（代码无注释）。
同样，网上流传的各种protocol或许都是可以使用的，但是写的人或许没有把实验方案调整的背景说出来。做一件事情，方法有很多种，但却没有解释为什么，我相信实验操作是可以训练完全不会成为问题，看懂protocol也是基本操作，理解方案设计，才是我们最终要掌握的东西。
在这里，确认质粒构建是否成功，即确认sgRNA是否正确插入到pSpCas9载体中：
（1）最直接的选择是将质粒送样测序，这种方法最为精准，但需要等待公司测序结果并且还需要付费，对于我所处的课题组来说，不是上上之选（这个我也做过）；
（2）我们的方法是：在LB平板上挑取2~3个细胞克隆，扩增后使用无内毒素质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证质粒
还是同一位好学的小伙伴提了问题，酶切能看出来20 bp大小的区别吗？先卖个关子，看到后面就自然明白为何了
image.png
1. 实验准备
常规试剂、仪器：琼脂糖凝胶电泳常用试剂耗材，琼脂糖凝胶电泳看胶仪器
限制性内切酶：实验室常用限制性内切酶，<u>BbsI核酸内切酶（贵）</u>
软件准备：Snapgene
2. 实验步骤
（1）设置实验反应
| Component | Amount (10 μL system) |
|---|---|
| plasmid (NC组、实验组) | 1 μg |
| 10x NEB buffer (根据所选内切酶匹配不同buffer) | 1 μL |
| BbsI | 0.3 μL (3 units) |
| Bs6I (在质粒上仅有一个酶切位点) | 0.3 μL (3 units) |
| ddH2O | up to 10 μL |
（2）37°C incubate 1 hour
（3）琼脂糖凝胶电泳，预测分子量大小<1 kb，使用 1.52%琼脂糖；分子量大小为110 kb大小时，选用1-1.2%
（4）结果分析示例
可见negative control (NC)组，在没有插入sgRNA时，在两个酶的作用下，于琼脂糖凝胶电泳上有明显可见的两条带（还有一条20 bp忽略不计）；
而插入sgRNA之后，由于BbsI酶切位点被破坏，此时只有BsrGI一个酶的作用，由于它本身在质粒上只有一个酶切位点，因此它也只能将环装的质粒，切开成为链状而已，所以在琼脂糖凝胶电影上，仅有一条带。
通过分析可知，我挑取的这8个克隆，全部为成功插入质粒。
image.png
插曲：我在第一次学做这些实验的时候，每次都反复检查、思考，担心自己出错。所以第一次做的时候，不仅仅是通过酶切结果确认插入是否成功，甚至把质粒拿去送测序，经由测序确认sgRNA的正确插入，如果有这方面顾虑的小伙伴，还可以尝试这个终极的办法（土豪请随意）。
注意事项：根据使用Cas9骨架质粒的不同，选用的核酸内切酶也会有所不同，因质粒而异，但是最终的目的都是一样的。质粒构建成功之后下一步是质粒转染。
番外：做一手漂亮的质粒转染（转染无压力的小伙伴可不看）
第一次做质粒转染是2014年，那时候用的还是lipo2000，转shRNA及小干扰RNA（RNAi）。多年过去，市面上有了更好的转染试剂，但仍有一部分细胞的转染难度非常大。本文仅就自己尝试过的转染方法进行简单介绍，目前认识到的转染方法有：
- 化学转染法：使用转染试剂打开细胞膜与核膜，从而输送质粒等物质；
- 电转法：使用电流冲击致使细胞穿孔，质粒得以送达细胞核。
对于293和部分肿瘤细胞，使用罗氏X-tremeGENE及Lipo 3000转染效率可轻松达到75以上（目测估计，如下图）。对于部分肿瘤细胞，尤其是胚胎干细胞，转染难度则非常大。以人胚胎干细胞为例，细胞抱团生长、个头小且核固缩，核膜难以打开，因而使用罗氏X-tremeGENE及Lipo 3000等常规转染试剂，转染效率几乎为0。
293转染效率.png
实验正文--将sgRNA-pSpCas9质粒转入293细胞~ 3-4 days
试剂公司的protocol人人手上都可下载，这里将默认大家都知道，只说个人认为重要的点，希望能抛砖引玉，得到大家更多的回复，分享更好的转染Tips。
1. 实验准备
细胞：293T工具细胞，目的细胞；
常规试剂：X-tremeGENE HP DNA Transfection Reagent-Roche （推荐），lipofectamine 3000 （life 公司）；Lipofectamine Stem Reagent (干细胞所需转染试剂），CloneR，Rock Inhibitor（干细胞相关需要）；Opti-MEM培养基
电转试剂盒：可选Bio-Rad和Lonza等公司产品。
质粒准备：前步骤产生的sgRNA-pSpCas9质粒
2. 实验步骤
（1）转染前优质状态细胞的准备 Day -3
转染前细胞状态非常重要，当然293作为工具细胞，即使两三天不换液，细胞融合度已达到百分之百，仍然几乎不影响细胞状态（不建议这么虐待细胞）。
对于肿瘤细胞，相信肯定有人遇到过，明明好好呵护着，但是不知道为啥传代之后总会半死不活半贴壁的样子，这里怀疑是消化多度引起，建议亲们降低胰酶浓度或者更换更温和的胰酶，同时传代后24小时不要进行常规换液，等到48小时后细胞可能会贴壁回去。
当然，每一种细胞的特性都不一样，比如我遇到的乳腺癌MDA-MB-231细胞，非常喜欢集中在孔板中间区域，如果消化过度则第二天不要换液，等到贴壁后再换液，状态再好总还有一些细胞圆圆的亮亮的在半贴在上方。
对于人胚胎干细胞，这细胞非常娇弱，一来培养基非常贵，且不能加抗生素，必须要生长在有feeder cell支持的环境或Matrigel coated的孔板；二来传代的时候还不能吹散成单细胞，最好是一小簇一小簇的掉下来，单细胞状态的人胚胎干细胞非常不易存活（使用Rock Inhibitor可以给单细胞状态人胚胎干细胞续命）；再来细胞培养密度超过70%就有分化的危险。
<u>因此：对于自认为状态不好控制的细胞，在转染前先传代种板，得到融合度70%左右状态良好的细胞，再将这些细胞接种到孔板中，保证接种后密度~30%，并且是单细胞状态。</u>
（2）转染前一天 Day -1
将状态良好的细胞接种至六孔板中；人胚胎干细胞可使用TryPLE消化至单细胞后，使用带Rock Inhibitor的培养基接种。
（3）转染当天 Day 0
检查细胞状态良好，且为单细胞状态好，按照转染试剂说明书准备DNA-转染试剂复合物，以下为我使用Lipo3000转染293时所用的条件：
Lipo3000和P3000试剂在使用前已混匀备用（各自震荡混匀而已，不是两个试剂混在一起），Opti-MEM培养基已放置室温备用，质粒为去内毒素质粒提取试剂盒提取（内毒素是导致细胞死亡的重要原因，有时候不是Lipo有毒性，而是质粒带毒）
EP管A：Lipo3000 + 125 μL Opti-MEM 混匀备用 Lipo3000的用量可据实际情况调整
EP管B：2.5 μg plasmid DNA + 125 μL Opti-MEM+ P3000 混匀
将EP管B混合物稀释到EP管A中，轻柔混匀后室温孵育10 minutes
将plasmid DNA-Lipo 复合物均匀滴加到细胞上
注意：在准备DNA-Lipo复合物时，无血清培养基不能代替Opti-MEM，Opti-MEM是增加转染效率的关键之一，转染时细胞培养基无需更换为无血清培养基。而人胚胎干细胞则需要使用Lipofectamine Stem这样专业的干细胞转染试剂，转染效率可达1-5%，别小看着1-5%，这是我的命根子，全靠这1%的转染效率，我才能挑到单克隆的。
（4）转染后转染效率检查 Day 1-3
带荧光标签的质粒可查看荧光表达情况，而抗生素标签的。。。就拿抗生素筛选吧。个人推荐使用带荧光标签的质粒，不仅看得到还能流式筛选出来，同时可以避免抗生素对细胞的影响。
关于电转的方法，等积累更好的经验之后我们择期再说，主要问题则是试剂太贵，没有仪器，细胞损伤大，状态不好恢复。下节我们将讨论质粒转染成功后的后续实验，再见。
