单细胞个性化分析之细胞注释篇

作者，追风少年i

当单细胞基础分析已经完善的时候，摆在眼前首要的问题就是，每个cluster具体是细胞细胞类型？只有在注释了每个群的基础上，才可以进行下游更加深入的个性化分析。细胞注释通常分为三步进行，1）自动注释（可选）、2）手动注释、3）验证。目前已经有了很多的软件和算法来识别细胞类型，但真正落在确定注释的时候，仍然要靠生物学背景和经验的积累。

10X单细胞细胞注释分析策略

单细胞数据自动注释，手动注释和验证的分析测略如下图^[1]。

图1 细胞注释分析策略示意图

首先，自动注释目前分两大类，一类是用预定的‘marker gene’（比如：在某一种类型的细胞中表达某一种特定的基因），称之为marker-based annotation。另一类是通过和一些已知的细胞类型比较细胞或cluster的基因表达模式来注释。称之为reference-based或Correlation-based annotation. 其次，自动注释方法具有很大的局限性，结果的确定还是需要人工矫正注释，目前手动注释仍然是细胞注释的金标准；最后，可以使用标记基因、通路分析和具有已知功能信息的差异表达基因的组合进一步手动推断细胞类型。 细胞注释通常使用独立来源进行验证，例如新的验证实验，或与互补数据的比较，例如空间转录组学数据。

自动注释

自动注释是一种非常快速的有效的方法，它通过计算机算法或者先前的生物学知识去标记细胞或者细胞cluster。主要的原则就是在单个细胞或细胞cluster中识别与已知细胞类型或状态的特征基因表达信号(模式或信号)相匹配的基因表达信号;然后给细胞或细胞cluster分配相应的标签。标签通常有一个相应的confidence score。自动注释分为两大类，依据“marker gene”，称之为marker-based annotation；另外一种依据参考数据集，称之为reference-based或Correlation-based annotation。基于自动注释有如下特点：

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marker-based annotation

marker-based方法一般会涉及到数据库：SCSig，PanglaoDB，CellMarker等都是常用的marker gene数据库。基因表达较低就不适用与marker-based方法。注释成功的关键在于marker gene应该在一个给定的细胞、细胞群或细胞类(例如免疫细胞)中有明确和一致地表达。基础marker注释仍然分为两种，一种是直接注释到cluster，这是自动注释中最常用的注释方法，另外一种是注释到单个细胞，这种方式具有很大的不确定性，但某些情况效果比较好。

基于cluster注释的方法最常见的就是cluster的差异基因匹配细胞“marker”，细胞类型的marker gene可以在现有的数据库中获得，虽然marker gene的数据库已经非常全面，但仍然有一些致命的问题，如下（以Cellmarker数据库为例）：

一、多（冗余）：

1、几乎在任何一个人或小鼠单细胞数据的矩阵里面随便挑选一个基因出来就是一种细胞标志物。

2、同一种组织同一种细胞类型收集到的marker gene多。（以小鼠脑为例，尤其体现在组织细胞）

二、marker gene来源差异：

Single-cell sequencing和Experiment，两种来源的marker gene差异较大，哪种更适合看情况而定。

三、引用率的问题：

绝大部分单个marker引用率都在个位数，完整定义细胞类型的marker gene set几乎全部都是原创，没有文章可以复用。所以依据数据库选择marker也需要很多的精力和尝试。

基于marker注释的方法总结如下：