[文献分享]泛基因组学揭示宿主和病原菌互作的全景图

这次与大家分享一篇2020年情人节发在science上的paper,"The pan-genome effector-triggered immunity landscape of a host-pathogen interaction"，文章利用泛基因组学的方法揭示了宿主和动态变化的效应子之间互作全景图，并鉴定了两个主要的NLR，一个已报道(ZAR1),另一个是novel(CAR1)，通讯作者是 David S. Guttman，译成肠道超人可还行。

Abstract

ETI(Effector-triggered immunity),由宿主免疫受体为了应对病原菌的效应子所产生，保护植物免受病原菌的侵染。然而，当前缺乏系统研究ETI的普遍性对全物种病原体多样性的影响。
我们构建了Pseudomonas syringae Type III Effector Compendium (PsyTEC)，为了降低5127个特异效应蛋白的泛基因组复杂性，从494个菌株的70个家族中筛选出529个具有代表性的等位基因。我们在模式植物拟南芥中筛选PstTEC，从19个家系(27.1%)中鉴定出59个激发ETI的等位基因(11.2%)，其中这些等位基因在96.8%的丁香假单胞菌中分布有同源基因。我们也鉴定了两个过去没有被好好阐述的宿主免疫受体，包括CAR1,它识别保守的效应子AvrE和HopAA1，并且预测发现94.7%菌株拥有能够被CAR1或ZAR1识别的等位基因。

Results

The Pseudomonas syringae Type III EffectorCompendium (PsyTEC)

首先对从28个国家100多个植物宿主中分离到的494株丁香假单胞菌进行了基因组序列分析，利用BLASTP对从公共数据库中收集到的菌株 III型效应蛋白序列进行同源比对。其中，在氨基酸水平有4636条序列是唯一的，在核酸水平有5127条序列是唯一的。并且按照严格的同源法则将这些效应子分为70个同源家族和89个亚家族。最终筛选出横跨丁香假单胞菌泛基因组效应子多样性的529个代表性效应子，使我们能够从宿主特异性和非宿主特异性的植株中筛选效应子诱导的ETI反应。

Widespread recognition of P. syringae effectors by A. thaliana

接下来我们想鉴定所有能激发Col-0 ETI反应的效应子。早先有人证明，对Col-0接种PtoDC3000会引起叶片黄化特征，而接种转入HopZ1a(一种effector)的DC3000，叶片仍然相对健康(FS4A,B)。基于此，我们开始构建PsyTEC这个库的转基因(携带hrp的native promoter)，并接种拟南芥进行筛选。其中，使用空载转基因做阴性对照，使用HopZ1a和AvrRpm1做阳性对照。与对照相比，将黄化病症状降低至少55%(所有植物均<45%黄化面积)的效应子被归为ETI诱导子。最终从529个效应子等位基因中筛选到59个ETI激发的效应子的等位基因,来自19个家族(F1A,table1)。

F S 4.png Table 1.png

为了展示我们新的ETI反应并不只局限在我们的筛选菌株(DC3000)，我们在另一菌株P.syringae pv. maculicola ES4326(从DC3000中分离出来的，且与DC3000一样，对拟南芥有较强的致病性)测试了所有的59个激发ETI的等位基因，筛选结果表明，尽管在新的背景下，但是59个效应子中有54个保持了它们原本激发ETI的能力。这部分结果表明，免疫激发表型在不同遗传背景下是高度保守的。

通过对细菌在侵染过程中的数量进行量化，揭示，在拥有激发ETI的效应子的丁香假单胞菌中，细菌的生长量减少，尽管不同菌株家族减少程度不同(F1B)。

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我们对诱导ETI的等位基因也引起了肉眼可见的HR的比例进行了评估，揭示了HR在激发ETI的效应子中相对少见。尽管效应子对植物组织黄化和细菌生长有重大影响，但是在11个家族中(总共19个)并没有观察到肉眼可见的HR症状(F1B)。

有意思的是，我们观察到在抑制细菌生长的程度和肉眼可见的HR存在显著相关性；引起强HR的效应子造成了菌的生长大量减少，然而那些没有引起肉眼可见HR反应的效应子对细菌的生长的抑制程度也较轻(F1BC)。这些数据说明，肉眼可见的HR在这套系统中似乎是一种特例，(前面基于的筛选表型是：加入效应子，与不加的相比，叶片相对健康)，因为肉眼可见的HR反应与更大量的病原菌生长减少有关。

最后，我们评估ETI在全球494个丁香假单胞菌株中理论上的普遍性。我们将效应子回帖到菌株基因组上(F2)。我们发现，494种菌株中有478种(96.8%)拥有至少一个高度相似(>95%蛋白相似度)的激发ETI效应子的同系物，而349种菌株(70.7%)拥有多个ETI效应子的同源物。

影响这种预测ETI普遍性的变量有3种：1，某一菌种多效应子的互作影响；2，染色质表达效应子和质粒表达不一样；3，每一个进化分枝有至多5%氨基酸差异，这些差异可能导致了不同的ETI结果。

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A. thaliana resistance to P. syringae is conferred by a small number of NLRs

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我们使用携带有单一效应子的PtoDC3000去接种NLR突变体来鉴定该突变体是否缺失ETI(F3A)，并量化叶片的黄化程度(F3B)和细菌生长(F3C)。在这个过程中，我们发现同一种NLR可以识别多种来自不同家族的代表性的效应子，并且我们鉴定到两种新的NLR：白细胞介素受体NLR ，At5g18360(HopB激发的抗性1，BAR1)，识别HopB；CC类的NLR At1g50180(CEL激活的抗性，CAR1)，识别AvrE和HopAA1。(AvrE和HopAA1由丁香假单胞菌高度保守的效应子位点所编码，该位点也编码三型分泌系统)

我们预测(这个地方可能是大胆猜测)，拟南芥通过极少数量的NLR来获得对整个丁香假单胞菌的抗性。事实上，预测得到仅仅8种NLR能识别96.6%的丁香假单胞菌(排除AvrE剩72.7%)，仅仅靠ZAR1和CAR1能识别94.7%的菌株(排除AvrE剩43.9%)。此外，68.0%的菌株存在多重抗NLR的机制。

A single ETI response can determine host accessibility

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最后我们想测试，单一NLR螯合效应子后是否会限制细菌侵染宿主。在分析诱导ETI的效应子的分布时，我们观察到毒性强的假单胞菌PmaES4326和与其密切相关的品系YM7930，在不同的激发ETI的效应子组合中表现不同，区别仅仅是YM7930中存在HopAR1; 这一观察结果为测试ETI能否决定宿主的可访问性提供了一个模型。

接病试验揭示，与PmaES4326相比，YM7930产生了微不足道的病症，并且菌的生长量低了两个数量级(F4)。我们推测，YM7930中的HopAR1，被拟南芥的NLR RPS5识别，是造成毒性限制的原因，对rps5突变体接病验证了这一猜想。还有其他类似结果共同揭示了，单个NLR和效应子互作有潜力去改变特定的宿主和病原菌的互作结果，但这并不足以去决定宿主的可访问性。

对我的启示：
1.工作量巨大，平时只有多做试验才能能给自己留有发挥的空间。
2.对大数据的分析，这往后可能会很常规。
3.生物体本身的复杂性决定了同一事物不可能只有正反两面，要多思考，追求细节。