2022-03-12

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ZmCGT1的自然变异是玉米丝中异荭草素积累的原因

摘要：尽管植物中已对不同类别的黄酮类化合物进行了很好的表征，但玉米中参与异荭草素生物合成的基因在很大程度上是未知的。在这里，利用294 个玉米自交系群体，我们对花丝上的异荭草素进行了靶向代谢分析，进行了全基因组关联分析鉴定了基因 ZmCGT1。ZmCGT1蛋白被表征为一种2-羟基黄烷酮C-糖基转移酶，可在脱水后将2-羟基黄烷酮C-糖基化形成黄酮-C-糖苷。此外，ZmCGT1过表达增加了异荭草素水平，而 RNA 干扰介导的 ZmCGT1 组合式降低了玉米丝中异荭草素的积累。此外，两个核苷酸多态性 A502C 和 A1022G分别导致氨基酸变化 I168L 和 E341G，被鉴定为导致异荭草素水平自然变化的功能多态性。总之，我们鉴定了在异荭草素生物合成中起重要作用的基因。ZmCGT1，为了解玉米丝中异荭草素水平自然变异的遗传基础提供了见解。鉴定出的ZmCGT1有利CG等位基因可进一步用于玉米营养品质的遗传改良。

结果：

1  天然玉米种群中异荭草素水平的变化

    异荭草素水平自然变异的遗传基础

天然玉米种群中异荭草素水平的表型变异和候选基因 ZmCGT1 的鉴定

3：ZmCGT1的分子系统发育分析及表达模式

            系统发育分析表明 GRMZM2G383404 被分组到 CGT 的进化枝中（图 3a），其被表征为类黄酮C-糖基转移酶。

4：ZmCGT1 在体外和体内的表征

为了确定ZmCGT1参与哪个通路，扩增ZmCGT1的CDS并克隆到表达载体pMAL-C2X中，构建表达麦芽糖结合蛋白（MBP）-ZmCGT1融合蛋白，MBP融合到N端。重组ZmCGT1在大肠杆菌中成功表达，直链淀粉树脂与MBP结合纯化，然后检测酶活性。

为了进一步验证异荭草素的生物合成途径，我们使用 ZmCGT1 和 ZmF2H 在本氏烟草中使用农杆菌介导的瞬时表达（fig4c）。由于缺乏作为底物的圣草酚，我们将圣草酚注射到表达 ZmF2H 和 ZmCGT1 的浸润叶片中。与以前的工作相一致，当添加圣草酚作为底物时，ZmF2H和 ZmCGT1 反应产物给出了一个明显的峰，其保留时间（RT；1.57 分钟）与真正的参考标准异荭草素相同（图 4d）。

这些体内结果表明，ZmCGT1 是一种 C-糖基转移酶，可在脱水后将 2 羟基圣草酚转化为异荭草素

5：ZmCGT1在转基因玉米中的活性

图 5. 转基因玉米丝中的 ZmCGT1 表达水平和异荭草素含量。

b 和 d) 过表达和 RNAi 植物中的异荭草素含量

6 ZmCGT1变异的多态性

图 6. ZmCGT1 变异背后的功能多态性鉴定

图 6. ZmCGT1 变异背后的功能多态性鉴定

(d) ZmCGT1 的氨基酸序列与四种基因型的比对。黑色矩形表示保守的 PSPG 框域

(e) 天然玉米变异中 ZmCGT1 的单倍型。 n = 10、33、105 和 145 表示自交系的数量。

(f) 72 种玉米自交系蚕丝中异荭草素水平与 ZmCGT1 表达水平之间的相关性图。

（g和h）四种纯化的ZmCGT1蛋白（包括ZmCGT1、ZmCGT1I168L、ZmCGT1E341G）的不同浓度UDP-葡萄糖（g）和Michaelis-Menten动力学参数（h）的产物（2-羟基柚皮素C-葡萄糖苷）的峰面积，和 ZmCGT1I168L/E341G

为了进一步验证来自不同天然变体的 ZmCGT1 活性，包括 ZmCGT1、ZmCGT1I168L、ZmCGT1E341G 和 ZmCGT1I168L/E341G 在内的重组蛋白在大肠杆菌中表达，然后进行纯化。

这些结果表明携带I168L和E341G替代的ZmCGT1表现出更强的活性。