文献信息

"Ultrasensitive lateral-flow assays via plasmonically active antibody-conjugated fluorescent nanoparticles"

https://doi.org/10.1038/s41551-022-01001-1

Srikanth Singamaneni ：美国密苏里州圣路易斯，华盛顿大学医学院 Siteman 癌症中心

摘要

LFAs快速且廉价，但其灵敏度比实验室检测低近1000倍。在这里，作者展示了等离子体活性抗体共轭荧光金纳米棒可以使传统的LFAs超灵敏。在20 min内，通过标准台式荧光扫描仪读出的等离子体增强LFAs在动态范围和检出限上比4小时长的金标准酶联免疫吸附法提高了约30倍，对严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (SARS-CoV-2)患者血浆中的抗体和鼻咽拭子中的抗原达到95%的临床敏感性和100%的特异性。通过廉价的便携式扫描仪也可以实现检测性能的相应改进，如我们在人血清样本中检测白介素-6和在鼻咽样本中检测SARS-CoV-2核衣壳蛋白时所示。等离子体增强LFA在灵敏度、速度、动态范围、易用性和成本方面优于标准实验室检测，并可能在即时诊断方面提供优势。

研究背景

LFA是最简单、最快和最便宜的即时（POC）诊断方法之一，为人群水平的疾病筛查提供了广泛的潜力。尽管已经引入了许多用于严重急性呼吸综合征冠状病毒 2 （SARS-CoV-2） 抗体和抗原的 LFA，但没有一种具有与基于实验室的诊断（例如实时荧光定量 PCR 逆转录 （RT-PCR） 和酶联免疫吸附测定 （ELISA））相媲美的灵敏度和定量能力。一般来说，传统的比色法LFA的灵敏度比这些标准实验室检测低~1,000倍，使用比色法进行诊断需要额外的基于实验室的确认性检测才能正确确定阴性结果。比色LFA通常不足以进行定量读数，因为相对于目标分析物浓度的变化，颜色变化有限。

2019 年冠状病毒病 （COVID-19） 大流行凸显了改进 LFA 的必要性，以实现精确和快速的临床诊断、大规模筛查和流行病学研究。RT-PCR和直接抗原检测一直是COVID-19诊断的主要方法，血清学检测对于确定感染分期和疫苗效力以及流行病学研究非常重要。这些诊断检测仅在合格的微生物学实验室提供，并且仍然依赖于专家、劳动密集型和时间密集型。这些限制阻碍了在流行病学激增期间每天所需的数百万次检测。因此，迫切需要诊断和筛查工具，这些工具不仅与基于实验室的测定一样准确，而且快速，易于使用，便宜，易于获得（用于家庭和POC），并且可扩展以进行快速人群水平的筛查。

提高LFA生物分析性能的努力包括使用荧光分子或量子点作为报告元件。尽管荧光报告基元提高了定量，但它们相对较弱的信号强度限制了其灵敏度和POC诊断效用，并且与传统胶体金纳米颗粒（AuNPs）相比，它们的低光吸收阻碍了传统LFA允许的直接视觉检测。此外，它们需要使用具有高灵敏度检测器或强大激发光源的LFA读取器。这些考虑限制了荧光LFA在大规模筛选和资源有限环境中的效用。

主要研究内容

1.等离子体荧光增强LFA的灵敏度

AuNPs在LFA中有一些限制，如低捕获率、低信噪比、低灵敏度，在大多数情况下仅限于Yes和No的定性检测。

为评估等离子体萤石是否可以克服AuNPs的这些缺点，我们在NC膜上比较了粒径相似的两种颗粒的性能，相同的浓度下，比较其比色信号强弱。等离子体荧光（和金纳米棒 (AuNR) 核）的局域表面等离子体共振波长通过修改分子荧光团的纵横比进行调整以匹配分子荧光团的激发和发射波长并选择纳米结构的最佳尺寸以在作者之前的研究的基础上，最大化荧光增强。作者着手确定产生可检测的可见或荧光信号所需的 AuNP 和等离子体荧光的最小数量。当连续稀释的 AuNPs（图 1b 和补充图 1）和已知浓度的等离子荧光体（图 1c 和补充图 1）被滴涂到硝酸纤维素膜上时，需要积累 ~106 AuNPs 和等离子荧光体来产生可辨别的可见信号（图 1d 和补充图 2）。然而，只需要约 102 个等离子体荧光即可产生可检测的荧光信号（图 1e 和补充图 3）。此外，需要积累约 0.6 × 106 个分子荧光团（800 CW，等离子体荧光的荧光单位）才能产生可检测的荧光信号（图 1f），表明等离子体可检测荧光信号的浓度阈值低约 6,000 倍荧光与分子荧光团相比。

等离子体荧光表现出与AuNPs几乎相同的比色信号（补充图4）。比色信号可实现定性视觉检测（通过肉眼），无需在相对高浓度的目标分析物下使用专门的读出设备，而荧光信号可实现低丰度分析物的超灵敏检测和定量。因此，等离子体荧光可用作双模式纳米标记（比色荧光），并在代表LFA的生物测定中提供超灵敏检测。

图S5. 图 1 | AuNPs 和等离子体荧光作为 LFA 的纳米标记。a，等离子体荧光的示意图，用作 LFA 中的双模式纳米标记（比色荧光），包括作为等离子体核心的 AuNR、作为间隔物的聚合物层、分子荧光团 (800 CW) 和作为识别元素的生物素。b,c, AuNPs (b) 和等离子体荧光 (c) 的透射电子显微镜图像。d，从用不同浓度的 AuNPs 滴铸硝酸纤维素膜获得的平均灰度值。插图：硝酸纤维素膜的 8 位 ImageJ 处理图像。e、f，从用不同浓度的等离子体荧光 (e) 和分子荧光团 (f) 滴铸硝酸纤维素膜获得的荧光强度。插图：硝酸纤维素膜的相应荧光图像。g，在暴露于不同浓度的链霉亲和素缀合的 AuNP 后，从硝酸纤维素膜获得的平均灰度值，生物素化 BSA 在测试位点用作捕获配体。插图：链霉亲和素缀合的 AuNP 的示意图。h，在暴露于不同浓度的链霉亲和素偶联的等离子体荧光后，从硝酸纤维素膜获得的荧光强度，在测试位点使用生物素化 BSA 作为识别元素。插图：链霉亲和素缀合的等离子体荧光的示意图。紫色箭头表示纳米缀合物的流动方向。数据为平均值 ± s.d.；n = 4次重复测试

2.p-LFA的生物分析性能

为比较 LFA 中等离子体荧光和 AuNP 的性能，作者使用了具有极高的结合亲和力的生物素-链霉亲和素偶联配对。

AuNPs 和等离子体荧光都用链霉抗生物素蛋白功能化，生物素化 BSA 用作捕获配体。然后将 LFA 条带置于不同已知浓度的链霉亲和素缀合的 AuNP 和等离子体荧光中 20 分钟（Fig.S 5）。纳米标记通过毛细管力沿着硝酸纤维素膜流动并被捕获配体捕获，导致纳米粒子在测试点积累。足够数量的纳米标记的积累将测试点的颜色转换为红色，表明阳性结果和目标分析物的存在。

AuNP 的比色信号的平均灰度强度和等离子体荧光的荧光信号随着纳米标记的浓度单调增加（图 1g，h）。值得注意的是，对于 AuNP ，需要约 10^7 个纳米粒子才能产生可辨别的可见信号；然而，仅约 10^3 个等离子体荧光就足以产生可检测的荧光信号。与 LFA 格式的 AuNP 相比，等离子体荧光的可检测信号的浓度阈值低四个数量级，这与上面讨论的滴铸方法一致。这些结果奠定了等离子体荧光可以作为超亮纳米标记用于超灵敏检测 LFA 的基础。

人 IL-6 捕获抗体和绵羊抗免疫球蛋白 G (IgG) 抗体被固定在硝酸纤维素膜上，分别形成测试点和对照点（图 2a 和补充图 14）。AuNP -LFA（图 2b）和基于分子荧光团的 LFA 的 LOD 计算为 166 pg/ml（图 2c，五参数逻辑拟合）和 362pg/ml（补充图 2c）。相比之下，荧光 p-LFA（图 2d）使检测低至 93 fg/ml（图 2e，五参数逻辑拟合），与传统的 AuNP相比，LOD 提高了 1,785 倍。基于 LFAs 并且至少比之前报道的 LFAs 高一个数量级。荧光 p-LFA (298 fg/ml) 的 LOQ 比比色 LFA (682 pg/ml) 的 LOQ 高 2,288 倍。此外，等离子体荧光将 LFA 的动态范围提高了近三个数量级。来自 AuNP 和 p-LFA 的比色信号表现出相似的 LOD，表明 p-LFA 的视觉检测能力没有损失（图 2f、g 和补充图 16）。此外，来自等离子体荧光的荧光信号能够在更广泛的分析物浓度范围内进行超灵敏检测和定量分析（图 2e、h）。

图 2 |人 IL-6 的定量 p-LFA。a，包含 IL-6 捕获抗体测试点和绵羊 IgG 对照点的 IL-6 LFA 条的示意图。b、c，基于 AuNP 的 IL-6 LFA 的示意图 (b) 和剂量依赖性平均灰度值 (c)，对应于从这些基于 AuNP 的 LFA 获得的不同 IL-6 浓度。d,e IL-6 p-LFA (d) 的示意图和 IL-6 p-LFA 的剂量依赖性荧光强度 (e)。f,g，基于 AuNP 的 IL-6 LFA (f) 和 IL-6 p-LFA (g) 的八位 ImageJ 处理图像，描绘了视觉读出模式。h，描述荧光读出模式的 IL-6 p-LFA 条带的荧光图像。i，ELISA、p-FLISA 和 p-LFA 的 RMC 曲线（参见计算的补充信息）。虚线表示 µ = 2 和 µ = 5 处的 RMC 截止值；虚线和 RMC 曲线的交叉点表示实现特定定量性能的浓度范围。对于 IL-6 p-LFA，μ < 2 在 0.13–86.0 pg ml−1 的浓度范围内，表明 IL-6 p-LFA 可以区分该范围内任何两个浓度相差至少 100% 的对应信号至少有 99% 的置信度。补充表 1 中列出了相关的 RMC 参数。j，IL-6 p-LFA 在 7 个月内的稳定性，如使用在 7 跨度内获得的四种不同标准曲线推导出的 IL-6 浓度的浓度估计误差所证明的几个月。

3.p-LFA用于人IL-6定量检测

刺突蛋白的重组 SARS-CoV-2 S1 亚基固定在测试点，绵羊 IgG 用作对照点（图 3a 和补充图 22）。作者首先确定了基于 AuNP 的 LFA（图 3b）和 p-LFA（图 3d）的生物分析参数，用于检测 SARS-CoV-2 S1 抗体。使用从 LFA 条带获得的比色信号，基于 AuNP 的 LFA 的 LOD 被确定为~1.05 µg/ml（图 3c）。相比之下，荧光 p-LFA 表现出 185 pg/ml 的 LOD（图 3e，五参数逻辑拟合），这代表了近 5,675 倍的改进。此外，正如预期的那样，从 AuNP 和 p-LFA 获得的平均灰度强度表现出相似的灵敏度，表明视觉检测能力没有受到影响（图 3f、g 和补充图 23）。然而，来自等离子体荧光的荧光信号能够在更广泛（高四个数量级）的分析物浓度范围内实现超灵敏检测和定量分析（图 3e，h）。与传统夹心 ELISA（图 3i）相比，荧光 p-LFA 显示 LOD 提高 165 倍，LOD 与 p-FLISA 相当（图 3 j）。

图 3 | SARS-CoV-2 血清学 p-LFA。a，SARS-CoV-2 S1 抗体 LFA 条的示意图，包含重组 SARS-CoV-2 S1 蛋白作为测试点的捕获元件和绵羊 IgG 在对照点。b,d，基于 AuNP 的 SARS-CoV-2 S1 抗体 LFA (b) 和等离子体荧光 SARS-CoV-2 S1 抗体 LFA (d) 的示意图。c，剂量依赖性平均灰度值，对应于不同浓度的 SARS-CoV-2 S1 抗体，从基于 AuNP 的 LFA 获得。e，SARS-CoV-2 S1 抗体 p-LFA 在 20 分钟内进行的剂量依赖性 SNR 比。f,g，基于 AuNP 的 SARS-CoV-2 S1 抗体 LFA (f) 和 SARS-CoV-2 S1 抗体 p-LFA (g) 的八位 ImageJ 处理图像，描绘了视觉读出模式。h，SARS-CoV-2 S1 抗体 p-LFA 条带的荧光图像，描述了荧光读出模式。i,j 剂量依赖性光密度和荧光强度，对应于不同的 SARS-CoV-2 S1 抗体浓度，通过在微量滴定板上实施的标准 ELISA (i) 和 p-FLISA (j) 获得，在 4 h 内进行

4.p-LFA用于SARS-COV-2抗原检测

p-LFA在同时进行PCR检测的患者样本中提供了所需的准确性和灵敏度。将其用于检测SARS-CoV-2 N蛋白。

通过固定N蛋白捕获抗体和绵羊IgG分别制备LFA条带上的试验点和对照点（图4a和补充图24）。从p-LFAs获得的比色和荧光信号随着N蛋白标准品浓度的增加而单调增加（图4b，c）。然而，计算出荧光对-LFA的LOD和LOQ比比色法好近400倍，确定了等离子体荧光作为超亮荧光纳米标记的重要性（图4d）。此外，与传统的夹心ELISA相比，荧光法p-LFA的LOD提高了37倍，LOD与p-FLISA相当（图4e和补充图25）。

图 4 |用于 SARS-CoV-2 N 蛋白和关注变体的 p-LFA。a, N 蛋白 p-LFA 条的示意图，包含 N 蛋白捕获抗体作为测试点和绵羊 IgG 作为对照点。b,c，用于 N 蛋白检测的 p-LFA 的比色法 (b) 和荧光法 (c) 读出模式。d，剂量依赖性平均灰度值，对应于不同浓度的 N 蛋白，从比色 p-LFA（黑色）和在 20 分钟内执行的 N 蛋白荧光 p-LFA（红色）的剂量依赖性 SNR 获得。e，剂量依赖性光密度和荧光强度，对应于不同的 N 蛋白浓度，通过在微量滴定板上实施的标准 ELISA（黑色）和 p-FLISA（红色）获得，在 4小时内进行。f，荧光 p-LFA（红色）和商业 POC 快速抗原试剂盒 (BD Veritor)（黑色）的比较。g，通过比色 p-LFA（灰色）、荧光 p-LFA（黑色）和 BD Veritor 测定的 PCR 阳性 NP 拭子样本（野生型 SARSCoV-2）中的 N 蛋白 SNR。h，比较比色法（灰色）和荧光法（黑色）p-LFA 在量化 35 个 PCR 阳性样本（19 个野生型 SARS-CoV-2 和 16 个 Delta）的 NP 拭子样本中存在的 N 蛋白浓度的能力变体）。ND，未检测到。i，NP 拭子样本中的 N 蛋白 SNR 检测结果为 COVID-19 阴性，不同季节性冠状病毒和其他呼吸道病毒呈阳性。

接下来，为了证明 p-LFA 相对于美国食品和药物管理局 (FDA) 紧急使用授权批准的现有商业化快速 POC 抗原检测方法的优势，作者将 p-LFA 的分析灵敏度与 BD Veritor 测定法进行了比较，该测定法分类浓度低于 50 ng ml-1 的样本被视为“推定阴性”（图 4f）。这意味着与商业抗原测试相比，荧光 p-LFA 的分析灵敏度提高了近 235 倍。在分析 PCR 阳性 COVID-19 患者样本（野生型 SARS-CoV-2）时，p-LFA 优于 FDA 批准的 BD Veritor 抗原试剂盒。BD Veritor 抗原试剂盒和比色 p-LFA 正确识别了 19 个 PCR 阳性 NP 拭子样本中的 8 个（分析灵敏度，42.1%），而荧光 p-LFA 正确识别了 19 个样本中的 18 个（分析灵敏度，94.7%）（图.4g）。在疾病早期（症状出现后 <10 天）的 14 个患者样本中有 13 个通过荧光 p-LFA（93% 灵敏度）检测呈阳性，而只有 7 个通过 BD Veritor 检测呈阳性（50% 灵敏度）（补充表3).值得注意的是，经 FDA 批准的 BD Veritor 抗原试剂盒只能用于阴性/阳性形式；然而，荧光 p-LFA 能够定量检测患者样本中的目标分析物（补充表 4）。作者还比较了比色法和荧光法 p-LFA 的定量性能。虽然 19 个样品中只有 3 个可通过比色 p-LFA 进行量化（高于 LOQ），但 19 个样品中有 18 个可通过荧光 p-LFA 进行量化（图 4h）。

为了进一步证实荧光 p-LFA 检测 N 蛋白的临床转化潜力，作者测试了 16 个 PCR 阳性 Delta B.1.617.2 变体（通过基元测序确认）NP 拭子患者样本。比色法 p-LFA 在 16 个 Delta 变异阳性样本中的 7 个中检测到 N 蛋白，其中只有 3 个是可量化的。然而，荧光 p-LFA 在所有 16 个样品中检测到 N 蛋白，其中 15 个是可量化的（高于 LOQ）（图 4h、补充图 26 和补充表 5）。作者还测试了 17 个 PCR 阳性 Omicron BA.1（通过基元测序确认）样本，并观察到荧光 p-LFA 在 17 个 Omicron（补充图 27 和补充表 6）变体样本中有 16 个返回阳性结果。所有 Omicron 阳性患者样本均在症状出现后的短时间内（1-2 天）收集，除一名患者外，所有患者的病情都非常轻微（补充表 7）。这些发现确立了 p-LFA 对 N 蛋白早期检测的功效。

最后，为了确定这种生物诊断技术在 POC 设置中的适用性，作者使用便携式、廉价的荧光扫描仪验证了 p-LFA 的性能。请注意，对应于等离子体荧光的斯托克斯位移比对应于常用荧光纳米粒子（例如量子点和铕纳米粒子（数百纳米））的斯托克斯位移小得多（~15nm）。据作者所知，市面上没有与等离子体荧光兼容的廉价、便携式荧光扫描仪。因此，作者开发了一种廉价的便携式荧光扫描仪，用于使用等离子体荧光作为纳米标记来读取 p-LFA。尺寸为 25 × 25 × 19 cm (L × B × H) 的扫描仪原型是使用常规可用的现成光学组件构建的（详见方法；图 5a 和补充图 28） .扫描仪的总成本为 1,429 美元，最昂贵的部件是激光，成本为 919 美元。值得注意的是，对于这项工作中描述的所有测量，激光（激发源）功率设置为最大功率的 1%，以避免荧光信号饱和。因此，这些组件可以小型化并用更便宜的组件替换以实现商业化。此外，便携式扫描仪可以使用电池供电，因此可以立即部署在资源有限的环境中。

作者制造了带有单独样品和共轭垫以及测试膜和吸收垫的全套LFA。将组装好的条带嵌入到标准的LFA盒中（图5b和补充图29）。通过使用行程致动器沿便携式扫描仪的光学系统沿图中的蓝色箭头方向平移盒来进行荧光测量。5b.这产生了从十张图像取平均值的像素值（信号强度）的轨迹，与以100μm为增量的测试膜的行进长度（图5c）。因此，有效的阳性结果在测试线和控制线有峰值，而阴性结果仅在对照线有峰值。在对照线上没有峰值的测试被认为是无效结果（补充图30）。

首先，为了比较便携式扫描仪与台式扫描仪的性能，作者确定了每个扫描仪可以检测到的纳米标记的最小数量。当连续稀释的等离子体荧光（图 5d 和补充图 31）和已知浓度的 800CW 分子荧光团（补充图 32 和 33）滴涂在测试膜上时，需要积累约 100 个等离子体荧光以产生使用台式扫描仪测量时可检测到的荧光强度（空白的平均值⟩3σ），并且便携式扫描仪需要约 200 个等离子体荧光（图 5d）。当使用台式或便携式扫描仪测量时，需要积累 ~0.6 × 106 个分子荧光团（未等离子体增强）以产生可检测的荧光强度。补充信息（补充图 34 和 35）中详细讨论了便携式扫描仪获取的数据和随后的数据处理方法。这些观察结果表明台式和便携式扫描仪在检测等离子体荧光的荧光信号方面的性能几乎相同。

接下来，为了演示 p-LFA 的 POC 兼容工作流程并比较便携式和台式扫描仪的性能，作者使用人 IL-6 作为模型分析物。人 IL-6 捕获抗体和绵羊抗 IgG 抗体分别印刷在硝酸纤维素膜上以形成测试线和对照线（补充图 36）。全条格式的比色 IL-6 p-LFA（图 5e）的 LOD 计算为~526pg ml-1（补充图 37）。相比之下，荧光 p-LFA（图 5f 和补充图 38）使检测低至 813 fg ml−1（图 5g 黑色，五参数逻辑拟合），使用台式扫描仪测量。值得注意的是，使用便携式扫描仪，IL-6 p-LFA 表现出相似的 LOD，916 fg ml−1（图 5g 为红色，五参数逻辑拟合）。通过比较 N 蛋白剂量-反应曲线（扩展数据图 1 和补充图 39 和 40），进一步证实了台式和便携式扫描仪几乎相同的性能。请注意，由于可用于结合分析物的时间更短（15 分钟对 20 分钟）和更小的分析物体积（70 微升对 100 微升），与上面讨论的半条形式相比，全条 LFA 的 LOD 更高以全条形式捕获抗体偶联的纳米标签。

最后，为了证明 p-LFA 在便携式扫描仪上的临床转化潜力和可能的 POC 应用，作者测试了来自 COVID-19 PCR 阳性个体的 28 份血清和 14 份 NP 拭子样本以检测 IL-6（扩展数据图2 和 3) 和 N 蛋白（补充图 41 和 42）。这些样品通过 15min p-LFA 进行测试，并使用台式和便携式扫描仪进行测量。台式和便携式扫描仪的定量结果显示出与 IL-6 的 Pearson r 值为 0.97（图 5h）和 N 蛋白浓度为 0.94（图 5j 和补充表 8）的良好相关性。同样重要的是，由 15min p-LFA 测定并由便携式扫描仪测量的 IL-6 浓度也与由基于实验室的 4 小时 p-FLISA 测定的浓度（Pearson r 值为 0.91）表现出极好的相关性（图 1）。5i 和补充表 9)。

图 5 |使用便宜的便携式荧光扫描仪验证 p-LFA。a，便携式荧光扫描仪的照片。b，研究中使用的 LFA 盒示意图和 p-LFA 的工作流程。S、T、C分别对应样品垫、测试线和控制线。蓝色箭头表示使用便携式扫描仪在 LFA 盒上进行的荧光测量的方向。c，使用便携式扫描仪获得的代表性正（黑色）和负（红色）信号。d，从 LFA 条获得的荧光强度（黑色球体）和曲线下面积（红色球体），用不同浓度的等离子体荧光滴铸，使用台式和便携式扫描仪扫描。e，全条 IL-6 比色 p-LFA 的八位 ImageJ 处理图像，描绘了视觉读出模式。f，描绘荧光读出模式的全条 IL-6 荧光 p-LFA 的荧光图像。g，通过台式（黑色）和便携式扫描仪（红色）测量的 15min IL-6 荧光 p-LFA 的剂量依赖性信号。h，通过荧光 p-LFA 确定并使用台式和便携式扫描仪测量的血清样品中 IL-6 浓度的线性回归图。i，与使用 15 分钟荧光 p-LFA 和便携式扫描仪进行的测量相比，通过 4 小时基于实验室的 p-FLISA 和台式荧光扫描仪测定的血清样本中 IL-6 浓度的线性回归图。j，通过荧光 p-LFA 确定并使用台式和便携式扫描仪测量的 NP 拭子样品中 N 蛋白浓度的线性回归图。数据为平均值 ± s.d.；n = 2 × 2次重复测试

研究结论

综上所述，作者已经证明等离子体荧光可以作为双模式（比色荧光）报告元素来克服 LFA 的长期局限性。具体而言，与实验室测试相比，p-LFA 克服了 LFA 的灵敏度有限、准确度低、动态范围小和定量能力有限的问题。等离子体荧光产生可辨别的荧光信号，其密度比传统比色 AuNP 所需的密度低 10,000 倍。各种分析物（IL-6、SARS-CoV-2 S1 抗体和 SARS-CoV-2 抗原）的 p-LFA 的生物分析参数（LOD、LOQ 和动态范围）比传统 LFA 提高了约 1,000 倍。p-LFAs 提供无标准定量检测，灵敏度比金标准 ELISA 高 10 倍以上，样品到答案的时间更短（20 分钟对 4-6 小时），并且解析分子浓度的能力相似作为基于实验室的测试。用于检测血浆和 NP 拭子样本中存在的 COVID-19 抗体和抗原的 p-LFA 实现了 >95% 的灵敏度和 100% 的特异性，显示出临床适用性。作者为读取 p-LFA 开发和优化的廉价便携式荧光扫描仪与作者使用的台式扫描仪一样有效。当应用于 COVID-19 阳性个体的人体样本时，使用台式和便携式扫描仪测量 15 分钟 p-LFA 的 IL-6 和 N 蛋白浓度表现出良好的相互关联性，并且与实验室确定的浓度相关4小时p-FLISA。作者相信，p-LFA 对于实现需要对生物分析物进行准确和定量检测的 POC 生物诊断非常有吸引力。此处报告的技术可以很容易地用于检测其他传染性病原体和疾病生物标志物，并且可以补充甚至取代用于诊断病原体感染和其他急性病症的实验室测试。