gateway

如今我们在克隆时，不再只有传统的限制酶克隆一种选择，相反，还有许多其它的分子克隆技术，它们可以在特定的资源、时间、实验需要下有效工作。自从1990s发现以来，Gateway克隆技术作为一种可以快速、高效将DNA序列转移到载体上的克隆方法流行开来。有合适的entry和destination载体时，可以使用Gateway克隆技术将目的基因克隆到各种各样的expression系统中。下面介绍Gateway克隆方法。

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Gateway克隆技术原理

由Invitrogen开发的Gateway克隆方法是𝛌噬菌体感染细菌时发生的整合和切割重组反应的体外版本。在体内，这些重组反应被噬菌体和细菌上的重组位点attP和attB促进。由于attP和attB位点间的重组，噬菌体整合到细菌基因组上，并形成两个新的重组位点（attL-左-和attR-右-）。在特定的环境下，attL和attR位点也能重组，导致噬菌体从细菌染色体上切除，重新产生attP和attB位点。重组反应交换位点实际上只发生在两个位点核心的15bp同源区域，核心外围的序列含重组酶的结合位点，所以也不可或缺。Gateway载体包含修饰了的att位点。

Gateway克隆技术依赖于下面描述的两个反应：

BP反应发生在连接有插入片段的attB位点和donor载体（供载体）上的attP之间。该反应受BP克隆酶混合物催化，生成entry克隆（入门克隆），其上含有attL位点连接的插入片段，而ccdB基因从donor载体上切除，两侧连接有attR位点。

BP克隆酶混合物：𝛌噬菌体整合酶（Int）、大肠杆菌整合宿主因子（IHF）

LR反应发生在entry克隆上的attL位点和destination载体（目标载体）的attR位点之间。该反应受LR克隆酶混合物催化，生成expression载体，其上含有attB位点连接的插入片段；并且一个含ccdB基因的DNA片段从destination载体上切除。

LR克隆酶混合物：𝛌噬菌体整合酶（Int）、切除酶（Xis）、大肠杆菌整合宿主因子（IHF）

一旦完成了BP和/或LR克隆，下一步则是转化、选择阳性菌落。entry克隆和destination载体携带不同的抗生素标记（上图中用质粒颜色加以区分），可通过使用抗生素选择出expression克隆。不同于储存含ccdB基因的载体时需要CcdB耐受菌株，进行重组反应时需要使用对CcdB敏感的大肠杆菌菌株，如DH5𝞪、TOP10、Mach1。重组前，ccdB基因存在于donor载体和destination载体上，进行BP或LR反应过程中与目的基因进行了交换。因为CcdB蛋白能抑制对CcdB敏感的大肠杆菌菌株生长繁殖，大多数可见的克隆应该包含重组载体。

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如何利用Gateway技术进行克隆

为了更好的理解这个过程，下面举一个使用Gateway克隆生成expression载体的例子：在哺乳动物细胞中使用慢病毒表达人类KRAS基因。

第一步：合成Entry克隆

有几种不同的方法可以合成entry克隆——连接有attL位点的KRAS基因

方法A：BP克隆反应，attB-PCR产物和含attP位点的质粒发生重组生成entry克隆。这种情况下，使用PCR在KRAS编码序列的两侧添加attB位点。如果选择该策略，含有合适的蛋白表达元件（核糖体识别序列、起始密码子、终止密码子、阅读框等）是重要的。

方法B：TOPO克隆，将插入片段的TOPO克隆插入到attL-entry-TOPO载体生成entry克隆。TOPO克隆添加短末端促进其插入到含attL位点的entry克隆中。

方法C：限制克隆，酶切含酶切位点的插入片段和attL-entry载体，并连接生成entry克隆。这个片段被插入到attL-entry载体的多克隆位点（MCS）中。

第二步：合成Expression克隆

获取expression克隆时，选择适合特定实验的destination载体是重要的。很多因素都会影响这个选择，如宿主细胞、预期蛋白表达水平和实验目的。对于哺乳动物慢病毒表达，可使用载体如pLenti CMV Puro DEST（w118-1）或者强力霉素（doxycycline）诱导的pLIX 402。选择的attR-destination载体将会和attL-entry克隆重组并产生expression克隆。

第三步：表达目的基因

通过酶切和测序鉴定expression克隆，确保克隆成功后就可以转化或转染到该实验使用的宿主细胞中。

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Gateway克隆方法的优点

兼容性和灵活性：一旦使用目的片段生成entry克隆，即可在一步重组反应中移动该DNA片段到任何expression载体中。

耗时短：Gateway克隆系统可在一天内生成expressin载体，而传统的酶切连接克隆需要2天以上的时间。Gateway克隆也能在同一管中完成BP和LR克隆反应，加速了attB-PCR产物直接克隆入destination载体的过程，其克隆过程简单，不需要限制酶切、连接或gel纯化步骤。

可进行多片段克隆：可以使用Gateway克隆在一个管内一次性在许多载体上插入多个DNA片段，可以特定的顺序和方向克隆多达4个DNA片段到Gateway载体上，产生expression克隆。这得益于载体的设计，它们含有修饰了的attB、P、L和R位点，可特异性、有方向性地重组：attB1位点仅和attP1位点反应，attB2仅和attP2反应，attL1仅和attR1反应，attL2仅和attR2反应。

固定阅读框：将DNA片段从一个Gateway载体移动到另一个上时，插入DNA片段仍在阅读框内。

高效：Gateway克隆中使用的正筛（抗生素）和负筛（CcdB）标记可提高克隆效率（>99%）。

普遍性：所有类型的DNA片段都能被克隆：PCR产物、cDNA或者基因组DNA，并且可以用于各种各样的生物体（从哺乳动物到大肠杆菌均可）。

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Gateway克隆载体