单基因纯生信分析套路 5+|单基因突变新思路1
各位小伙伴们好呀，虽然马上放长假了，但是今儿也是要认真工作的一天吆！小编今天给大家带来了一篇九月份刚刚发表在EBioMedicine(IF=5.736)杂志有关突变的文章。目前，TP53与KRAS/ATM/EGFR/STK11的共突变已被证实对免疫检查点抑制剂的反应具有预测价值，但该研究发现并非所有的TP53突变(主要指错义和无义突变)都能有效预测肺腺癌患者(LUAD)对ICIs的治疗效果。下面我们详细看一下文章内容吧~
Specific TP53 subtype as biomarker for immune checkpoint inhibitors In lung adenocarcinoma
数据和方法
作者首先从TCGA和TCPA中获得了癌症患者的level 3、4的转录组和反相蛋白阵列(RPPA)数据，包括563名LUAD患者的RNA-seq，其中354名有RPPA数据；然后，用相应R包提取基因表达数据用于相关性检验，并用xCELL分析了肿瘤免疫微环境的细胞异质性；下载了GSEA分析基因特征与TP53错义/无义突变间的关联；R包ClusterProfiler用于绘制富集功能通路的点图；最后还计算了IFN-γ(干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节功能)得分。
接下来，作者评估了TMB，TMB定义为TCGA中通过全外显子测序、MSKCC和Geneplus数据库中通过NGS检测到的肿瘤编码区发生的非同义突变。然后，从已发表的数据中得到了HDR评分(想要的小伙伴去文章的参考文献找哈)和DDR通路分布，并通过R包GSVA采用单样本GSEA计算了一组调节DNA损伤修复(DDR)通路的基因集(共276个基因)的富集分数，然后R包pheatmap被用来对富集得分进行层次聚类。
此外，作者还从医院收集了44名接受抗PD-L1/1治疗的患者(记为GDLCI群体)，并用NGS检测了TP53的状态。LUAD已发表的临床数据也被用来验证ICIs的临床疗效。
结果
TP53错义与PD-L1水平升高有关
有分析意向（http://gaptechsxr.mikecrm.com/1vdMmqy）生信人WX公众号
研究利用Wilcox检验比较了不同TP53突变亚型与PD-L1表达的关联，发现同TP53野生组相比，TP53错义突变亚型与PD-L1 mRNA表达的升高显著相关，但是无义突变组未发现差异。用RPPA数据分析时也得到了相同的结论，对各组TP53以及PD-1表达的比较也未发现组间差异(图1.a)。在来自MSK队列的66名具有PD-L1 IHC数据的LUAD患者中，作者利用Fisher精确检验发现TP53错义突变组PD-L1 IHC评分≥1的患者比例明显高于TP53野生组，对PD-L1表达的分层分析，也得到了类似的结论(图1.b)。Spearman检验表明p53和PDL1在蛋白水平上呈显著正相关(图1.d)，但组间的RNA水平无明显差异。以上结果意味着TP53错义突变有可能通过无义突变引起的p53丢失以外的机制来改变PD-L1的表达。
图1. LUAD患者TP53错义和无义突变与PD-L1的相关性
TP53错义突变与JAK-stat通路富集有关
作者对TCGA中的RNA-seq数据做了GSEA分析，以比较TP53错义和无义突变之间的差别，发现TP53错义突变组显著富集了与P53信号转导、凋亡、同源重组和JAK-STAT信号通路有关的特征(图2.a-b)。图2.c中的热图描述了不同突变组中，JAK-STAT通路RNA水平的分布，可以发现TP53错义突变组显著富集了该通路。进一步分析，发现TP53错义突变组，其BCL2L1,AKT2, IL2RA 和TYK2这些JAK-STAT通路的中蛋白水平高于无义突变组，尤其是BCL2L1的表达显著增加。此外，同TP53野生型相比，TP53错义突变组的IFN-γ得分显著要高。
图2. GSEA分析和热图
TP53突变与TMB
P53通过调节多种DNA损伤反应(DDR)机制来增强基因组的稳定性，因此作者意欲寻找与P53突变相关的DDR通路。首先对三组不同突变状态的TMB数据进行比较后，发现错义突变和无义突变组的水平均高于野生组，两个突变组的新抗原水平和HR评分也具有相同的特点(图3.a)，但两个突变组之间未检测到显著差异。为了进一步确定TP53状态对DDR的影响，该研究计算了所有DDR相关通路的GSEA评分，并绘制了图3.c中的热图，可知TP53错义和无义突变都与HR、MMR、BER和NER中的富集特征有关，但与直接修复(DR)和非同源末端连接(NHEJ)无关。这些结果说明TP53错义突变和无义突变都可以通过破坏HR和MMR，来显著增加TMB和新抗原的水平。
图3. TP53突变与TMB等的关系
TP53无义突变显著富集肿瘤相关M2巨噬细胞和中性粒细胞
肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)具有肿瘤抑制或促进的作用，Tregs、TAMS和M2这些细胞也被证实与抗肿瘤功能和免疫治疗的不良反应有关。由此，研究基于RNA表达数据计算了不同TP53突变组的免疫细胞水平，与野生型TP53组相比，TP53错义突变组和无义突变组的CD8+ T幼稚细胞水平均显著升高，CD4+记忆T细胞仅在含有较多TP53错义突变的LUAD样本中富集(图4.a)。此外，Wilcox检验结果表明TP53无义突变组的M2巨噬细胞水平显著高于错义突变组，中性粒细胞也有类似的表达模式(图4.a-b)。
图4. TME组分与不同的TP53状态相关
TP53错义突变与较好的免疫反应有关
在MSK群体中，共有147名LUAD患者接受抗PD-L1单治疗，数据表明，TP53突变组的无进展生存期(PFS)明显长于TP53野生型，其中，错义突变组的PFS更长，但并不显著(图5)。作者还发现，这三组与其他基因共突变的情况一致，没有检测到显著差异。
图5. TP53状态与ICI治疗预后的关系
用GDLCI数据集验证的结果如图6所示，可知，TP53突变组和野生组的PFS无显著差异，但是TP53错义突变组的PFS显著长于无义突变组。而且无TP53突变的LUAD患者，其mPFS稍长于无义突变组。TP53错义突变组的mPFS明显长于野生组，但并不具有显著性。此外，由图6.e的swimmer plot图可发现，GDLCI队列中5例富集了TP53无义突变的LUAD患者，均表现出较差的PFS，且未获得持久的临床效益。同时，错义突变的LUAD患者表现出显著增加的PFS，但在该群体中，并不是所有的TP53错义突变都具有更长的PFS，这里应该进一步分析突变的位置和类型。
图6. GDLCI中抗PD-1/L1单药治疗预后与TP53的关系
接下来，研究比较了GDLCI群体中两个不同突变组与其他基因的共突变分布情况，未发现显著差异(图7.a)，TP53错义突变组的mPFS明显延长。已有研究表明，KRAS与TP53共突变具有较好的ICIs治疗效果，而EGFR突变与较差的ICIs临床疗效有关，于是作者分别剔除了这两个基因发生突变的样本，发现错义突变组的生存期依旧显著延长(图7.b-c)。
图7. GDLCI数据集的共突变分布
两个突变组对具体药物治疗的反应
多个研究表明在NSCLC中， TMB与PD-1联合CTLA-4阻断的疗效有关，且是一个独立的生物标志物。因此，作者进一步分析了抗CTLA-4联合抗PD-L1治疗在LUAD不同TP53突变组的临床效益。Checkmate-012队列包含59名非鳞状非小细胞肺癌患者，接受了nivolumab联合ipilimumab作为一线治疗。数据显示，TP53突变组PFS明显延长，TP53错义突变组的mPFS为22.4个月，也显著高于TP53野生型组(图8.a-b)。此外，TP53错义突变组的反应率也明显高于野生组(图8.d)，两例TP53无义突变患者对联合的治疗反应也很好(图8.c)。查看原文章的小伙伴要注意一下，文中的图号标错了吆！
图8. Checkmate 012群体的预后与突变状态的关联
有分析意向（http://gaptechsxr.mikecrm.com/1vdMmqy）生信人WX公众号
总的来说，作者将LUAD患者分为三个不同的TP53突变组，证实了它们在PD-L1表达、IFN-γ评分和TME组成上存在着显著差异，在预测ICIs治疗效果方面也是不同的。整个分析流程比较简单，方法有些单一，但是基本上能做的也都做了，发个5点多的杂志很可以了。好了，今天的文献就为大家解读到这了！Have a nice day!
