【文献分享】棉花根盐处理单细胞图谱

土壤盐碱化问题日益严峻，已经成为全球范围内制约植物生长发育的主要环境因子之一。根系在植物应答逆境胁迫中具有重要的调节作用，作为环境胁迫下最先感知并作出反应的器官，其耐逆机理还不明确。

2023年10月，Plant Communications在线发表了安阳工学院题为“Transcriptional Landscape of Cotton Roots in Response to Salt Stress at Single-cell Resolution”的研究文章。基于单细胞转录组学分析，研究人员在单细胞分辨率下构建了棉花根尖响应盐胁迫的转录图谱，揭示了盐胁迫下植物根系的细胞异质性、根系类型的差异和分化轨迹，为阐明植物抗逆的分子机制奠定了坚实的基础。

=======实验设计=========

对于5天的棉花seedling进行处理，分为4个组：CK，salt1（100mM盐处理0.5h），salt2（100mM盐处理1h），salt3（150mM盐处理0.5h）（图1A）。

=========实验结果========

1. 构建棉花根组织在盐处理下面的单细胞图谱

利用前面的4个样本，共获得了56,281高质量的细胞，平均每个样本7,035个细胞。降维聚类之后获得13个类（下图B）。依据已知的marker基因进行细胞类型注释，获得了10个不同的细胞类型（下图C和D）。

2. 原位杂交验证细胞类型

根据上图的聚类，作者选取了13个不同cluster的marker基因（下图A和B），进行原位杂交验证（下图C）。验证结果也充分说明了细胞类型注释的准确性。

3. 根重要细胞类型的分化轨迹

因为前面通过相似性分析发现epidermis和root hair细胞类型比较相似（这个好像是废话），所以作者接着分析了epidermis和root hair之间的分化轨迹（下图A和B）。然后把轨迹上差异基因做了GO富集分析（下图C），图C中显示和epidermis相关的基因在M2，而和root hair相关的基因大多数在M4，结果也表明root hair大概率是有epidermis分化而来的。

接着，作者又把proximal meristem和stem cell niche的细胞拿出来做了轨迹分析（说实话，其实做这两个轨迹分析背后的逻辑我不太理解）。结果发现proximal meristem细胞大多数是有stem cell niche来的（下图D和E）（但是其实做monocle的人都知道，这个分化的起点和终点是可以自己设置的，我觉得结论反过来也是可以的吧）。

4. 鉴定根中盐特异细胞类型响应模式

为了发现根在盐处理条件下是否存在特异细胞类型响应，把CK和salt进行对比，尝试去鉴定特异响应的细胞类型。从细胞数目所占的比例来看（下图A-C），root hair和epidermis细胞类型在低浓度盐处理下比例增加，但是高浓度下比例减少。相反的，root cap和cortex则是低温度减少，高浓度增加。QC和endoermis响应则更为复杂（但是我个人觉得这种图的表现形式，不太好看，并且确认统计检验结果）。

然后作者又把几个salt处理的数据作为一个整体和CK对比（下图D-F），然后发现差异度就没那么显著了。root hair, epidermis, root cap是显著上升的，而cortex, xylem, endodermis则是显著下降的（同样缺点是没有统计检验结果）。

5. 盐处理下差异基因功能富集结果比较

然后作者把CK和salt进行对比，尝试去鉴定细胞特异响应的差异基因（下图A）和转录因子（下图B）。然后作者对于差异的基因做GO和KEGG富集分析（下图C和D）（说实话，这个图是真难看）。

6. 激素在root tip中对于盐处理的响应pattern

因为在以往的报告中，激素在逆境条件下起着重要的作用，所以作者查看了激素合成和响应在不同细胞类型中的响应pattern（下图）。可以看出激素主要在epidermis，root cap和xylem细胞中富集，不同的激素响应规律和富集的细胞类型不一样。

7. GH3.6在盐处理过程的功能机制解析

因为在以往的报告中，激素在逆境条件下起着重要的作用，所以作者查看了激素合成和响应在不同细胞类型中的响应pattern（下图）。可以看出激素主要在epidermis，root cap和xylem细胞中富集，不同的激素响应规律和富集的细胞类型不一样。

因为GH3.6不仅被注释为epidermis的marker基因，而且在auxin signal中响应。所以作者构建了GH3.6的VIGS植株，并观察了在盐处理下面的各种表型，比如DAB staining，ion leakage等（下图）。