双荧光素酶报告基因检测实验流程
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Author: Junfei Xie
Date：JULY 5, 2023
材料准备：
耗材：避光酶标板、1 mL、200μL、20μL移液器及吸头、300μL八联排移液器、马克笔、15 mL离心管、2 mL离心管、一次性吸液槽、卫生纸、U盘、手套、鞋套
试剂：Dual-Luciferase® Reporter Assay System
操作流程：
1. 细胞铺板
转染时细胞密度：当细胞密度达到70-80%时进行转染可以取得较高的转染效率(具体密度可根据细胞生长速度进行铺板)。然而，不同细胞的最适转染密度都不尽相同。因此在初次转染某种细胞时，可以通过预实验先确认该细胞最佳的状态及转染密度。
2. 细胞转染
参考技术文档《贴壁细胞转染程序》。
3. 细胞裂解
待转染至相应的时间后，弃培养液，PBS（室温）洗一次，将细胞裂解液完全覆盖细胞充分混匀，按以下方式加入细胞裂解液，充分裂解细胞，摇床15min；
细胞裂解液：于50 mL离心管中加入4体积无菌水，然后加入1体积的5*细胞裂解液（1:4比例）。
| 培养板 | 96孔板 | 48孔板 | 24孔板 | 12孔板 | 6孔板 |
|---|---|---|---|---|---|
| 裂解液用量 | 50 μL | 80 μL | 100 μL | 200 μL | 400 μL |
注意事项：
- 5X PLB应保存在-20°C，稀释后的(1X) PLB可在4°C下保存长达一个月;建议在使用前准备好所需的PLB量。
- 用PLB制备的细胞裂解物中含有的萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶在室温(22°C)下至少稳定6小时，在冰上稳定16小时，-20°C可以短期储存(最多1个月)；但是建议在-70°C下长期保存。
- 将细胞裂解物进行超过2-3次冻融循环可能导致荧光素酶报告酶活性逐渐丧失。
4. 荧光检测
1) 样本预实验
不同细胞裂解液梯度摸索注1：
取5ul、10ul、15ul、20ul细胞裂解液进行测定
注1：不同批次转染细胞数目不固定，裂解后产物量不同，过高则信号过曝导致读数异常；
计算Stop&Glo Reagent试剂所需的量，现用现配；
即取8 μL 50X Stop & Glo Substrate加入到392 μL的Stop & Glo Buffer中。
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2) 样本检测
a) 设定好样本在96孔板排列，计算好所需试剂体积，同上；
b) 将样本加入到黑色不透光的96孔酶标板中，每孔加步骤1初筛的上清液x μL；
c) 立即加入80 μL预先混好的LAR II，静置2s后，检测萤火虫荧光素酶的活性，重复测定3次注2；
d) 每孔添加80 μL预先混好的Stop&Glo Reagent，静置2s后，检测海肾荧光酶活性，重复测定3次;
注2：加入酶活后，荧光信号不断地衰减，连续测定3测后取平均值，最能反应的真实变化。
其他注意事项：
- 生物学重复是在转染步骤，进行2-3次独立复孔的细胞转染；
- 双荧光比较灵敏，重复测定计算比值变异度低，所以无需进行技术重复；
- 排版不宜过度，过多则最先加入的荧光衰减，而后加的才开始激发。尤其推荐使用排枪，最大程度上减少加样时间对结果的干扰；
- 酶促反应，试剂平衡至室温才能达到最佳效果；
- 试剂不宜加入过多，超过200ul容易飞溅污染仪器设备，笔者曾做过50 μL+50 μL，结果与标准操作并无差异。
5. 数据分析
建议在每个 细胞 培养板中都设置空白对照，实验组和对照组。
空白对照：未转染细胞，Firefly luciferase和 Renilla luciferase检测值分别记为 OF、 OR
实验组：转染细胞经实验化合物处理，Firefly luciferase和 Renilla luciferase检测结果分别记为 TF、 TR
对照组：转染细胞不经处理组 Firefly luciferase和 Renilla luciferase检测结果分别记为CF、 CR
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