《专家共识》|如何评价单菌基因组质量
《微生物组测序与分析专家共识》涵盖从微生物采集与保存、DNA提取建库、高通量基因测序和数据分析以及质控标准品等全流程、各环节的建议和标准。其中包含了对扩增子测序、元基因组、单菌基因组、转录组测序及数据分析各环节的操作方法、评价指标以及相应软件的介绍，今天小编就带大家来看看，关于单菌基因组测序与分析都有哪些衡量标准，看看你的基因组是否合格？
对分离纯化培养的单菌进行DNA提取、文库构建、测序和全基因组组装。单菌全基因组的从头组装（denovo）或重新组装的生物信息分析流程主要包括：序列质控、全基因组组装、基因组质量评估、基因注释和功能分析等（图1）。
图1.单菌基因组测序生物信息分析流程图
[if !supportLists]1、[endif]数据质控
在进行正式分析前，要先对下机数据进行质控。二代数据质控过程主要包括：移除低质量序列、过短序列、接头序列等，同时移除连续低质量碱基(Q<20)数大于40%的读序。Pacbio三代平台数据的过滤参考阈值如下：移除长度较短的读段 (≤500 bp) 和低质量的读段(Mean Concordance>0.8)。
Tips1：二代测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值（Q）用来衡量测序的准确度。如碱基的质量值20，表示该碱基被识别错误的概率为10-2，即1%，30的错误率为10-3，即0.1%。Q20与Q30则表示质量值≧20或30的碱基所占百分比。Illumina官方一般以Q30作为评价标准。
[if !supportLists]2、[endif]全基因组组装
二代测序数据读长（reads）较短 (150–300 bp)，无法跨越基因组中某些长于reads的重复序列区域，导致组装结果片段化，即形成大量长的 Contig 和 Scaffold。结合三代测序长读序和二代测序高精度的优点，进行“三代加二代”的全基因组组装，即应用单分子测序的长读长进行最初的基因组组装，然后结合高精度的二代测序的短读序对组装的序列进行校正(Polished)，结果产生了更长的序列和更准确的功能注释。
常用的高通量基因测序平台的单菌组装软件有SOAP denovo或 SPAdes 等软件。二代/三代混合组装可应用 Unicycler。三代组装软件有 Canu、HGAP、Falcon 或 SMRT Link 等软件。“三代加二代”组装时，可应用软件 bwa 比对高通量基因读序到矫正后的三代组装序列上，进行再校正，提高序列精度。（详情点击“阅读原文”获取）
[if !supportLists]3、[endif]基因组质量评估
组装后的单菌全基因组应进行标准的质量评估，建议遵从美国能源部联合基因组研究所(DOE JGI) 发布的定义不明微生物基因组的MISAG标准。
相关文章2017年发表在《nature biotechnology》，《Minimum information about a single amplified genome (MISAG) and a metagenome-assembled genome (MIMAG) of bacteria and archaea》
MISAG(单菌基因组标准)分别从组装质量（assembly quaility）、基因组完整性（genome completeness）、基因组污染率（contamination）三个方面进行量化评判（table1），文章同时也对各部分评估所用软件/工具进行了说明。
基因组组装质量评估可以参考scaffold/ contig的总数、N50/N90 长度、最长/最短长度、序列中的 N 含量 (N rate) 和 GC 含量 (GC%) 等参数进行综合评估。细菌完成图可参考染色体是否成环 (gap=0)。真菌精细图谱质量的质控参数为 N50>2M (真菌 survey 的杂合率<0.8)。评估基因组组装的完整性和质量可应用基于保守基因集的 CEGMA 和单拷贝看家基因的CheckM 等软件。（详情点击“阅读原文”获取）
[if !supportLists]4、[endif]基因注释和功能分析
细菌编码基因的预测可应用Glimmer 、Prodigal 和 GeneMarkS 等软件。非编码 RNA 的分析可应用 RNAmmer、Barrnap 或 tRNAscan-SE。其他基因组组分预测有：CRISPRFinder 和 PHAS等软件预测前噬菌体； RepeatMask 和 TRF (Tandem Repeats Finder) 等软件识别基因组的重复序列，功能预测可应用HUMAnN2 或 BLAST+。
参考文献：
[if !supportLists]1、[endif]《“微生物组测序与分析专家共识”细则》；
[if !supportLists]2、[endif]《微生物组测序与分析专家共识》；
3、Bowers, R., Kyrpides, N., Stepanauskas, R. et al. Minimum information about a single amplified genome (MISAG) and a metagenome-assembled genome (MIMAG) of bacteria and archaea. Nat Biotechnol 35, 725–731 (2017). https://doi.org/10.1038/nbt.3893
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