一个 PhD 的日常挑战：怎样找一个适合的细胞分选方法！

猜想大家可能都有过这种经历，导师要求你在实验室建立一个新的实验方法。

上个月的时候，我导师和我说，想找一个细胞分选的好方法，从人的全血里做 CD4 + T 细胞的基因功能研究。

看起来还挺简单的，但搜了一下发现，市面上细胞分选的方法实在太多了……

所以到底哪个合适呢?

在看了几个小时的 paper 后，我了解到，分选主要是根据所需细胞的属性。对免疫细胞的划分则是依据表面标志 CD 分子。我组的研究，主要就针对 CD4 + T 细胞这一特定类群，表面含有 CD45、CD3 和 CD4 标记。而表达 CD4 就是辅助性 T 细胞的特征。

最普遍的方法就是用特定抗体偶联磁珠来捕获细胞。细胞与磁珠结合后，再利用磁分离器来分选。但具体选用何种方法，还是要看下游的研究。由于我是想在选出的 CD4 + T 细胞上做基因功能研究，因此不能采用会影响靶细胞基因表达或者会激活细胞的方法，还得获得大量高纯度、高活力的细胞。

阴选是做基因研究广为推荐的一种方法，间接的获得目的细胞。通常目的细胞上没有筛选标记。通过使用与所有非目的细胞结合的抗体混合物，将非目的细胞从样品中去除，就留下目的细胞了。用磁分离器将无关细胞去除的这个方法其实不是很有效，因为一些没与抗体结合的细胞会被结合的细胞一起连带着选出去。因此，为了提高纯度，分选步骤得重复好几遍。所以阴选我暂不考虑，因为我最终要的细胞需要很纯且不能受分选影响…

因为细胞表面上有 CD4 标记，也许可以阳选。阳选是直接将目的细胞特异性分选出来，并且几乎不含非目的细胞。通常使用特定的抗体与磁珠偶联，结合目的细胞。而在这种情况下，高亲和力抗体被标记在细胞上，会对许多下游研究产生影响。有时，结合在细胞上的抗体和磁珠可以被二抗的加入而移除。或者，结合物有的时候会自然而然的分离。但大部分情况下，磁珠被保留在目的细胞上，可能会对细胞造成机械压力。

能不能有一个方法把阴选和阳选的优势都结合起来啊…

后来在看到这篇 paper 时，Mohr et al. (2018)， 提到了一个叫「Fab-TACS」的技术，作者直接从全血中通过免疫亲和层析来纯化淋巴细胞，新颖又高效。

这个方法是来自德国的一家叫 IBA Lifesciences 的公司，他们针对细胞分选有多种 kits，而且包含我要做的 CD4 + T 细胞。这个会不会就是我要找的呢？

查了一下，Fab-TACS 技术是指 Fab-based Traceless Affinity Cell Selection，亲和无痕细胞分选。在 IBA 独家的 Twin-Strep-tag® / Strep-Tactin® 基础上，运用免疫亲和层析的原理，利用细胞表面抗原分子 CD marker 中的 Fab 片段，捕捉及释放目标细胞。能次次精准的从全血、小鼠脾脏和单细胞组织悬液中选出不带标签，未经激活的细胞。

原理也很便于理解。Fab-TACS 柱子填充有经 Strep-Tactin® 包被的细胞级琼脂糖基质，能与含有 Twin-Strep-tag 的 Fab 片段结合。

接着，将全血或是血液样本加入柱子，目的细胞就可以与 Fab 片段结合了。非目的细胞被洗掉。

最后，加入生物素（biotin），因为 biotin 亲和力较高，会中断 Fab 片段与 Strep-Tactin® 的结合，此时 Fab 片段也同时脱离下来。Fab 片段因亲和力的降低，自发脱离细胞表面，无标记的目的细胞就到手啦！

4 步操作，就可以直接从全血中分离细胞，这确实是非常简单了。而且不涉及到磁珠的使用，也不用制备 PBMC，因此实际上其实是可以省下很多时间的！当然，他们公司也提供有能进行自动分细胞分选的设备 FABian®。

Fab-TACS 技术属于阳选，可以得到非常纯的 CD4 + 细胞，选出的细胞没有标记，细胞表面无高亲和力抗体或者磁珠。可以将帮助我进行基因研究而而且不影响 CD4 + 细胞的基因表达。

查了一下这个德国的 IBA 厂家后，发现他们在中国的代理商是达科为，咨询后我了解到，如果想进行测试，可以尝试一种 Fab-TACS Gravity introductory kit，就是我们通常说的入门 kit，而且现在正好有 5 折的活动！！这种性价比高的 kit 一直是实验室采购的首选啊。于是我就直接订了一个 human CD4 + Fab 标记的 Fab-TACS Gravity introductory kit。

收到 kit 后，我迫不及待开始了我的 CD4 + 细胞分选。

像之前了解的一样，不用事先制备 PBMC！另外操作步骤也像描述的那样简单，得到的数据如下：

01

高得率

分选后，我的 CD4 细胞得率为 99%，Fab-TACS 厉害呀，这真是非常高了。

02

高纯度

为了测定细胞纯度，我用 CD3-APC / CD4-FITC 将细胞染色，上流式。死细胞以 DAPI 染色先行排除，并使用不同 FSC / SSC 信号来排除双粘体和细胞碎片。结果显示 CD4 细胞的纯度很高，仅有少量红细胞污染！

03

高活力

细胞的活力对于下游研究，尤其是那些长期的实验是很重要的。Fab-TACS 的可逆性可以确保细胞的高活力和免疫活性，在我的测试中，细胞活率达到了 99.6%。

拿着这些数据去找我的导师，他可以说是相当的满意了！完全没想到我能找到一个高效新颖，且性价比贼高的方法～

所以 po 出这篇经验来，也许可以帮助到在苦苦找方法，或者是同做细胞分选的实验汪们。我这次使用的 Fab-TACS 技术其实不仅涵盖 human 免疫细胞的分选，同时还有 mouse T 细胞。如果有兴趣的话，IBA 厂家现在针对 Fab-TACS 入门 kit 还有 5 折的活动，截止日期是到 5 月底！

订购方式和详细技术原理给大家放在「阅读原文」中啦！点击看详情！

文章来源：IBA

图片来源：IBA、站酷海洛

题图来源：站酷海洛