CRISPR-Cas9基因敲除sgRNA设计

大佬说，我只说一次，你自己要记住
以最火热的p53为例

Step 1 先找p53基因序列

1. NCBI--输入p53并选择物种human：tumor protein p53 [Homo sapiens (human)]

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene

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2. Ctrl+F，输入sequence，快速定位（当然其实拉下去就是了），点击Genebank

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3. 下载p53基因序列

4. 用SnapGene软件打开序列，并简单了解每个元件

最好是可以学一下SnapGene这个软件的使用方法（有视频），个人认为，自行查资料理解每一个元件的含义和作用，可以帮助更快的补充背景知识。通过将散落的知识点集合起来，最后拼凑成自己的知识地图。

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那么，为什么看起来好像这些mRNA都一样，怎么不只放一条完事了？不是滴。。。还有不一样的mRNA。 image.png

在学生信的时候，听到过一个词，“可变剪接”，有了初步印象之后，在这里才算是实实在在看到了，我认真的数了数，mRNA画了15条，TP53蛋白也画了15条。那么我们可以理解为，TP53有15个亚型，当然，每个亚型都有自己的mRNA。

Step 2 分析敲除位点（找到合适的敲除位置）

怎么样才能通过尽量少的sgNRA数量，去敲除尽量多的TP53蛋白。既然是做knockout，那一定是要所有的亚型都不能表达。那么既然如此，就是要敲除掉这些亚型共有的区域，而且越前面越好（如果只敲除尾巴，TP53合成了半个身子，半个身子的TP53说不定也能起作用），另外，也不能敲除掉内含子（说是，如果敲掉了，可能会形成进的剪接，就有新的蛋白出现）----知识点好伐~

1. 发现所有亚型共有区域

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2. 查看详细信息，得知第一个segment（片段）是从12417-12498，一共82 bp

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3. 在Sequence中查看，复制一整个segment的碱基序列如下

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segment碱基序列atggccatctacaagcagtcacagcacatgacggaggttgtgaggcgctgcccccaccatgagcgctgctcagatagcgatg

Step 3 设计sgRNA

首先，先附上鼎鼎大名的张峰实验室提供的网页 https://zlab.bio/guide-design-resources

1. 打开网页，选择网页工具--博德研究所

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2. 粘贴序列，一步到位

3. 查看结果

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我没有写结果怎么查看，或者分析结果耶，因为。。。因为做到这里，真正想学的人，感兴趣的人早就去看了。

4. 选择目的序列

略略略，哈哈哈哈哈~~