基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析（

本期接着上期内容，继续给大家介绍基于MS/MS的数据非依赖法非标记定量蛋白质组学蛋白质互作分析。

如之前文章里所述，尽管我们这里将其归为数据非依赖方法，但SRM和衍生物是需要已知化合物和跃迁列表的目标性方法。这种目标性意味着随着假设的发展，样品需要再分析以锁定不同的目标化合物。在许多情况下，正在分析中的样本要么产生成本高，要么不可替代，因此测试新假设目标不太可能。因此，需要用能够检测所有化合物碎片离子的方法来进行量化。将这一概念与SRM区分开来很重要，因为数据采集并不针对特定化合物。值得一提的是，直到现在，数据非依赖分析的使用还集中在蛋白质鉴定上，而非定量蛋白质。

在过去的几年中，有许多方法使用数据非依赖的分析策略来分析样品，这些策略通常会将质谱仪分离范围内的所有化合物片段化。这些方法试图平衡数据收集的周期时间与样本复杂性和梯度长度，并试图通过改变母体离子选择的特异性来获得足够的LC峰定义。尽管MSE和所有离子碎片化（AIF）等方法使用大约2秒的循环时间，但理论上它们可以以更快的循环时间进行扫描。这种形式的DIA利用一个宽带通滤波器来选择离子和之后所有离子的碎片。对于MSE或最近的HD-MSE，TOF分析仪用于直接或在离子运动分离后检测碎片离子。AIF利用基于FT的轨道捕获仪来探测碎片离子，因此应该提供更高的探测分辨率。在这些仪器中，增加停留时间以提高分辨率会缩短整个循环时间。这些方法，在大量的母体离子片段化后，片段离子分离的特异性可能会有损它们的唯一性。

与上述DIA方法相比，PAcIFIC或MSMSALL等方法通过使用更窄的质量过滤器来提高母体离子的选择性。PAcIFIC使用2.5 amu的进行过滤，例如45da，可以使用基于LC的分离技术进行后续分析。然而，为了覆盖整个母体质量范围，需要多次进样，大大延长了分析时间。在MSMSALL中，离子以0.7amu的大小进行过滤，可提供最大的母体离子选择性，但同时具有较长的循环时间，因此该技术目前主要应用于基于浸液的实验，如脂质分析。

DIA方法分析某个质量窗口，并在与色谱法兼容的循环时间内跨过整个目标质量范围，平衡了AIF/MSE的循环时间和PAcIFIC/MSMSALL的选择性，可提供允许高选择性和快速LC兼容循环时间的方法（图例）。关于离子阱和TOF仪器的方法之前已经说过，尽管使用离子阱进行离子检测，可能对化合物鉴定有用，但不太适用于量化，因为这取决于对非卷积碎片离子的分析。关于SRM使用的讨论，以及产生干扰Q3检测质量离子的共洗脱物种的问题，也适用于对DIA方法使用低分辨率碎片离子扫描，其中质量选择装置的更宽隔离窗允许更多离子进入检测系统，以复合碎片离子卷积的可能性。

图5. SWATH DIA示意图。这里，第一个质量选择四极杆在一个定义的窗口中分离和传输离子，该窗口包含许多不同的母体离子。这种离子混合物通过碰撞诱导的碎片在碰撞池中碎片化，并传输到TOF分析仪，在那里所有的产物离子的分辨率都大于20000。从产生的混合MS/MS光谱中提取高分辨率XICs（如高分辨率SRM）可以消除潜在干扰，为定量结果提供特异性。隔离窗跨过整个目的质量范围：窗的数量、宽度、覆盖的质量范围以及累积时间都对总循环时间有贡献。

文献参考：StephenTate. et al, Label-free quantitative proteomics trends for protein-proteininteractions, Journal of Proteomics, 2013.

本文由百泰派克生物科技整理编辑。百泰派克生物科技专注于基于质谱的蛋白质组学服务，结合亲和纯化与Label-free、SILAC或SWATH定量技术，百泰派克生物科技开发了一系列蛋白质组研究策略，其灵敏度高、重复性好，非常适合蛋白质相互作用的研究。