非肿瘤生信，WGCNA+免疫+双硫死亡+单细胞+表达验证！投稿到

期刊：Frontiers in Immunology

研究概述：

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是一种常见的肝病，其发病机制步明确。双硫死亡是最近发现的一种细胞死亡模式。本研究旨在探讨双硫死亡相关基因（DRGs）在NAFLD发病机制中的潜在作用。

作者从数据集GSE126848和单细胞 RNA 数据集GSE136103中获得NAFLD 相关的基因表达谱。首先评估了 DRG 在 NAFLD 和正常组织中的表达，随即采用加权基因共表达网络分析（WGCNA）和差异表达分析交叉鉴定出两个关键的NAFLD特异性差异表达DRGs（DE-DRGs），分别是DSTN和MYL6。之后，为了探究这些关键DE-DRGs的生物学功能和免疫调控作用，作者进行了免疫浸润分析、功能富集分析、共识聚类分析和单细胞差异状态分析。最后作者利用组织学和RNA测序转录组学测定法对人类肝组织样本验证了DRGs在NAFLD患者中的表达和生物学功能, 发现在NAFLD患者中大多数DRGs的表达水平显著升高，表现为与炎症、氧化应激和疾病严重程度相关的 MYL6 升高，具有良好的诊断特异性。

关于非肿瘤生信，我们也解读过很多，主要有以下类型
1 单个疾病WGCNA+PPI分析筛选hub基因
2 单个疾病结合免疫浸润，热点基因集，机器学习算法等
3 两种相关疾病联合分析，包括非肿瘤结合非肿瘤，非肿瘤结合肿瘤或者非肿瘤结合泛癌分析
4 基于分型的非肿瘤生信分析
5 单细胞结合普通转录组生信分析

研究结果：

构建共表达网络和关键模块的筛选

在转录组学数据集GSE126848中，作者通过中位绝对偏差筛选前 5000 个基因用于进行 WGCNA 分析，为数据集建立了一个聚类树（图2A）， 图2B则是通过对具有临床特征的样本进行聚类而形成的树状图。以无标度 R2 为基础，作者评估了无标度网络的拟合指数和不同软阈值功率的平均连通性（图 2C）。最终，其通过分层聚类确定了 13 个模块（图 2D）。热图展示了每个模块与NAFLD之间的相关性，其中黄色模块与NAFLD的联系最强（图2E）。图2F显示，黄色模块基因不仅与黄色模块本身具有很强的相关性，而且与NAFLD也表现出很强的相关性。图2G则是以基因热图的形式展示了基因共表达网络。图2H显示了模块与临床性状权重之间的联系。因此，作者在后续研究中重点关注黄色模块中的564个基因（见补充结果）。

NAFLD特异性DEGs的鉴定及其KEGG富集分析

另外，作者利用DESeq2包分析了GSE126848中对照组与NAFLD组之间的差异基因，发现了2702个上调的DEG和2075个下调的DEGs。图3A显示了DEGs的火山图。韦恩图显示，在 DEG 和 WGCNA交集中，存在293 个上调基因，19 个下调基因（图 3B）。图3C展示了交集差异基因在两组样品中的表达水平。KEGG富集结果表明上调的NAFLD特异性DEGs与核糖体、氧化磷酸化、非酒精性脂肪性肝病、糖尿病性心肌病、运动蛋白、吞噬体和PPAR信号通路有关。相反，下调的NAFLD特异性DEG参与与戊糖和葡萄糖醛酸相互转化、花生四烯酸代谢、亚油酸代谢和视黄醇代谢相关的信号通路,其中有17个基因在非酒精性脂肪性肝病信号通路中显著富集。（图3E）

NAFLD患者的免疫微环境

为了研究NAFLD患者的免疫微环境，作者应用了三种算法，CIBERSORT，xCell和ssGSEA，以揭示相对免疫细胞组成。研究结果表明，NAFLD患者与非NAFLD患者之间的免疫微环境存在差异（图4A）。此外，免疫细胞之间存在密切的相互作用，M1巨噬细胞和M2巨噬细胞之间存在显著的负相关，活化的树突状细胞和滤泡辅助性T细胞之间存在强烈的正相关（图4B）。在NAFLD患者中，浆细胞、CD8 T细胞、CD4记忆活化T细胞、γδT细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞和静息树突状细胞的比例高于对照样品。然而，NAFLD样品中活化的NK细胞，M2巨噬细胞，静息肥大细胞和中性粒细胞的百分比较低（图4C，D）。所有这些结果都表明，免疫微环境的改变在NAFLD的发病机制中起着至关重要的作用。

NAFLD和双硫死亡簇中关键DE-DRGs的鉴定免疫浸润分析

依据之前的研究作者收集到23个与双硫死亡相关的基因（DRG），并在对照组和NAFLD组中检测了以上基因的表达模式。图5A显示了23个DRG在染色体上的位置。图5B显示，两组有7个DRGs差异表达。在与WGCNA获得的黄色模块基因相交后，鉴定出与NAFLD相关的两个关键DE-DRGs，MYL6和DSTN。随后，作者使用基于关键 DE-DRG 的一致聚类算法对样本进行分组。通过聚类分析获得两个双硫死亡簇（图5C，D）。与簇 2 相比，关键 DE-DRG 在簇 1 中上调（图 5E）。为了阐明免疫微环境中两个双硫死亡簇的特征，作者进行了免疫浸润分析（图5F）。图5G所示的相关性分析表明，主要DE-DRGs与调节性T细胞、CD8 T细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞和静息树突状细胞之间存在显著的正相关。另一方面，DE-DRGs与M2巨噬细胞以及静息肥大细胞之间存在显著的负相关。作者还应用GSEA分析了两个簇的生物学行为。GSEA富集分析显示，线粒体中的电子传递链系统、氧化应激诱导衰老、生物氧化酶代谢紊乱、甘油三酯代谢、程序性细胞死亡疾病以及促炎和促纤维化介质在簇1中上调（图5H），所有这些都与NAFLD的发病机制有关。

GSE136103单细胞数据集的处理和NAFLD细胞图谱的构建

通过scRNA-seq数据作者进一步探讨了关键DE-DRGs在NAFLD患者中的免疫调节作用。经过严格的质控筛选，后续分析共纳入20896个基因和23929个优质细胞（图6A）。如图 6B 所示。其最终根据先前研究和 SingleR 注释的标记基因鉴定了 10 个主要细胞谱系，包括 T/NK 细胞、B 细胞、浆细胞、树突状细胞（DC）、肥大细胞、内皮细胞（EC）、肝星状细胞（HSC）、肝细胞和胆管细胞。这十个群体包含来自对照组和NAFLD患者肝组织的细胞（图6C）。UMAP图可视化了样品中的不同细胞簇（图6D）。

关键DE-DRGs在MPs簇中表现出显著的差异表达

使用带有默认参数的Nebulosa （v1.10.0） 软件包对关键 DE-DRG 的基因表达进行加权核密度估计(图7A&B)。作者使用聚合信号生成了一个多维缩放（MDS）图，以探索样本之间的相似性。第一维（MDS1）展示的是对照和NAFLD样品的分离，而第二维（MDS2）用于分离细胞簇（图7C）。小提琴图结果显示MYL6仅在单核吞噬细胞中显著差异表达（图7D）, 火山图显示了二者在不同组中各个细胞内的差异表达，其中DSTN在HSCs簇和MPs中差异表达（图7E）。因MYL6的表达趋势与RNA转录组数据相似，因此作者将后续研究重点放在MYL6上。

MYL6 可能参与 NAFLD 患者的 Kupffer 细胞极化

作者将单核巨噬细胞（MP）重新抽取聚类为 5 个不同的聚类（图 8A），它出现了 2 个单核细胞簇（后缀为 Mono）和 3 个巨噬细胞簇（后缀为 Macro）。与“平均”细胞相关的系统发育树显示，2个Mono簇与3个巨噬细胞簇一样，作为分支节点密切相关（图8A右图）。MYL6主要在C01、C02和C04簇中高表达（图8B）。热图显示，C02-CD5L-Macro 和 C05-FCN3-Macro 表达了高水平的 Kupffer 标志物，如 CD5L、MARCO、VCAM1 和 CD163（图 8C）。此外，通过检查先前定义的特征基因，作者观察到每个MPs亚群的功能状态不同，C02-CD5L-Macro和C05-FCN3-Macro的Kupffer mod评分较高，Macro簇中的吞噬作用mod评分高，所有簇中的促炎mod评分相似，C02-CD5L-Macro的M1 mod评分最高，C03-RNASE1-Macro的NASH相关巨噬细胞（NAM）mod评分最高（图8D)。随后，各簇的差分状态分析显示，MYL6主要在C01-S100A8-Mono和C02-CD5L-Macro中显著差异表达（图8E，F）。C02-CD5L-Macro的GSEA富集分析结果表明，与对照组相比，NAFLD患者在促炎信号通路、与调节细胞死亡相关的信号通路（例如，调节性坏死和铁死亡）以及与硫化物代谢相关的信号通路（例如，硫化物氧化导致硫酸盐）中表现出上调（图8G）。这些结果表明，MYL6可能通过M1表型Kupffer细胞在NAFLD患者中发挥重要作用。

NAFLD患者MYL6的表达及其与临床参数的密切相关性

作者收集了 16 名患者的肝组织，并进行了 HE 染色和 RNA-seq 分析（图 9A）。结果表明，与对照组相比，NAFLD组的大多数DRGs显著上调（图9B）。此外，热图显示，MYL6与Kupffer细胞特征基因、M1表型巨噬细胞特征基因和氧化应激相关基因的表达呈显著正相关（图9C）。作者根据MYL6中位表达将10例NAFLD患者分为高表达组和低表达组，并在两组之间进行GSEA分析。MYL6高表达组表现为炎症相关通路如炎症通路、细胞因子和炎症反应上调和脂肪酸代谢途径和氧化应激相关途径的增加（图9D）。值得注意的是，在NAFLD中，MYL6表达与疾病严重程度之间存在正相关关系（图9E，F）。此外，作者从TCGA数据库中下载了与肝细胞癌（LIHC）相关的数据，发现NAFLD-LIHC患者的MYL6表达明显高于对照组（图9G）。此外，为了验证MYL6在NAFLD诊断中的有效性，作者基于自己的数据进行了ROC logistic回归分析，发现MYL6的AUC值为0.967（图9H），表明MYL6在NAFLD诊断中具有良好的敏感性和特异性。进一步的Spearman相关性分析显示，肝内MYL6 mRNA水平与血脂代谢相关指标如NAS以及血清TC、TG和LDL-C浓度呈显著正相关，与血清HDL-C浓度之间存在负相关（图9I-M）。

研究总结：

该篇文章是双硫死亡在非肿瘤类疾病中的研究，作者主要思路是利用基因共表达基因和差异分析先筛选出与NAFLD疾病有关的基因，随后与将收集到的双硫死亡相关基因集取交集，进一步缩小范围，找出了与NAFLD相关的DRGs，接着作者在单细胞数据集中探索了这两个基因的表达模式，最后利用自己的收集样本的临床转录组数据进行验证。本文主要有两个关键上分点，第一，作者并非简单地利用单细胞数据检测筛选出的DRGs在不同细胞簇中的表达，其在发现了MYL6在单核巨噬细胞(MP)簇中差异表达后，针对MPs分化发育特点进一步对该细胞簇进行重新聚类，发现了MYL6与 M1表型Kupffer细胞的联系，这为后续如果作者想延续性研究打下了基础。第二个上分点，在于作者利用了手里有的样本资源，对所推测MYL6的功能进行的验证。总而言之， 本文中的数据量并不多，所用的分析手段也常见，是值得借鉴的一篇文章。