10X单细胞空间联合分析揭示了受不同基质细胞群调节的follic

hello，大家好，我这个loser又来了，又是单细胞空间联合，不知道大家的单细胞空间数据分析的怎么样了？？？发文章了没？？？

今天我们分享的文献在Temporal and spatial dynamics mapping reveals follicle development regulated by different stromal cell populations，希望有朝一日，我也可以成为知识的创造者~~~~

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Abstract

follicle发育是一个复杂的动态过程。follicle被包裹在基质中，一旦follicle发育，follicle就会在不断生长的过程中从皮层移动到髓质，最后到达皮层排卵。许多这些过程不能仅用毛囊来解释。通过对小鼠出生后follicle发育关键时间点的单细胞和空间转录组测序，发现ovarian基质细胞不仅是构成 ovarian的主要细胞群之一，其细胞群和空间位置也与follicle发育密切相关。通过对细胞通讯的分析发现， ovarian基质细胞是细胞间通讯的主要传递者，它们发出的许多信号被颗粒细胞和卵母细胞接收，参与follicle发育。 ovarian基质细胞不是同质细胞群。将单细胞类型与其空间位置信息相结合，将 ovarian基质细胞分为四种类型，即结构性基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，每种类型在follicle发育中发挥不同的功能。对不同空间位置和不同类型基质细胞的深入研究将扩大对follicle发育动态的理解，为 ovarian相关疾病的治疗带来新的靶点和新方法。

Introduction

ovarian由两部分组成：实质和间质。follicle是 ovarian的功能单位，包括 ovarian实质，决定了女性的生殖寿命。它由卵母细胞和嵌入 ovarian基质中的体细胞层（颗粒细胞和膜细胞）组成。 ovarian的大部分，包括皮质和髓质，由具有不同特征的基质组成。大多数follicle嵌入 ovarian皮质的基质中，并在 ovarian髓质的基质中成熟。历史上， ovarian生物学的研究主要集中在受卵母细胞和颗粒细胞（GCs）控制的follicle发生上，而follicle发生中存在许多未解决的问题，仅靠这两种细胞类型无法解释。除了构成follicle的细胞外，嵌入follicle的 ovarian基质对follicle发生有很大贡献，但没有得到足够的重视，因为它是理解follicle发生复杂过程的关键。

ovarian基质由一般成分组成，例如免疫细胞、血管、神经、细胞外基质和未完全表征的基质细胞的混合群体。大部分 ovarian基质包含未完全表征的基质细胞，包括成纤维细胞样、梭形细胞形和间质细胞。ovarian基质细胞在follicle发生中具有重要作用，特别是在原始follicle的激活和膜细胞的分化中。次级follicle可以使用体外培养系统单独生长，而原始和初级follicle必须在含有基质成分的器官培养物中激活。此外，所有在体外培养后成功生产人中期 II (MII) 卵子的研究都使用机械方法而不是酶消化来从 ovarian组织中分离follicle，因为酶消化会对follicle造成损害，同时还能保持残留基质细胞的紧密结合，这些细胞与follicle进行密集的细胞间通讯，并可能具有分化成其他关键细胞类型的能力，例如膜细胞。此外，基质细胞共培养可以改善早期follicle的生长和存活，这对于将体外培养系统成功转化为灵长类动物和人类follicle至关重要。 ovarian基质细胞不仅为follicle发育提供结构支持，而且与follicle具有复杂的双向旁分泌信号。几种生长因子是follicle发生的关键调节分子，包括成纤维细胞生长因子、转化生长因子 β、血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子和胰岛素样生长因子。然而，follicle和基质细胞之间的特定细胞 - 细胞分泌信号仍不清楚。

尽管有这些新见解，但对 ovarian基质细胞的理解仍然有限，许多问题仍未得到解答。 ovarian基质细胞的不完整表征和分类导致研究中的混淆，这些研究报告了有关基质细胞的发现而没有进一步鉴定。 ovarian基质细胞不是指单个同质细胞群。最近的单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 研究证实了多个基质细胞clusters的存在，但缺乏对整个 ovarian基质细胞类型的全面和完整的表征。基质细胞的分布和亚型可能会因其在 ovarian中的位置而异（例如，皮质与髓质）。随着follicle的生长和排卵以及黄体的发育，基质细胞的分布也可能发生变化，伴随着周期性的结构变化。整个生殖寿命的变化也很明显，包括纤维化胶原蛋白的增加，如老年小鼠、女性和灵长类动物的 ovarian所示。对于这些不完全表征的基质细胞类型，仔细的本体论、进一步的标记识别以及对区域细微差别的关注是关键的下一步。

scRNA-seq虽然可以在单细胞水平获得基因“时间动态表达”的信息，但还是不可避免地丢失了组织样本的空间信息。 因此，无法获得有关基质细胞的足够信息，因为它们在follicle发育过程中表现出空间变化。 随着空间转录组学技术的发展，分析有能力更好地表征 ovarian基质细胞和follicle发育过程中的变化，并且随着研究人员了解它们在生理和病理过程中的个体作用，可以用更精确的名称来指代它们。 因此，进行了 scRNA-seq 和空间转录组学分析，涵盖了代表不同follicle发育阶段的五个重要时间过程，以充分了解 ovarian基质细胞在follicle发育中的作用，并完全表征和分类 ovarian基质细胞。

在这项研究中，生成了小鼠出生后 ovarian follicle发育的单细胞图谱和时空基因表达动态，阐明了 ovarian基质细胞在follicle发育中的重要作用。 细胞间通讯分析描绘了follicle发育不同阶段的细胞类型组之间复杂的细胞间通讯关系，并揭示 ovarian基质细胞是 ovarian中调节follicle发育的主要外向信号细胞类型。 将 ovarian基质细胞完全表征为四个亚群，即结构基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞，并进一步进行标记鉴定。 这些基质细胞亚群中的每一个在follicle发育中发挥不同的作用。

Result

A single-cell map and spatiotemporal gene expression dynamics of follicle development in the postnatal ovaries of mice

为了生成小鼠 ovarian的细胞图，说明follicle发育过程中的时间和空间变化，通过单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 和空间转录组学方法（10× Genomics Visium 载玻片和高分辨率显微镜）。 五个时间点的 ovarian被整合到scRNA-seq 分析中：出生后第 3 天、第 5 天、第 7 天、3 周和 8 周。 三个时间点的 ovarian被整合到 10× Visium 分析中：出生后第 7 天、第 3 周和第 8 周。 后一种方法允许探索follicle发育中的细胞特征，以获得详细的细胞群和时间变化。

能够生成 58,319 个细胞的 ovarian图谱，并根据其标记的表达识别出 21 个被分配细胞身份的clusters。 为了进一步识别clusters，根据已知的细胞类型标记基因分配clusters。 细胞特异性标记基因是卵母细胞（Sycp3）、颗粒细胞（Amhr2）、基质细胞（Col1a1）、内皮细胞（Cdh5）、上皮细胞（Krt19）、免疫细胞（Ptprc）、平滑肌细胞（Des）和 类固醇生成细胞 (Ptgfr)。 这些clusters可分为九个主要细胞类别：（i）基质细胞，（ii）颗粒细胞，（iii）卵母细胞，（iv）内皮细胞，（v）上皮细胞，（vi）免疫细胞，（vii）平滑细胞 肌肉细胞，（viii）类固醇生成细胞，和（ix）未定义的体细胞。 为了进一步获得基因特征的动态模式，鉴定了九个主要的细胞类别clusters特异性标记基因。 在这些细胞类型中，基质细胞和GCs占了绝大多数。

为了系统地绘制由 scRNA-seq 识别的细胞类型在 ovarian内的位置，使用了 10× Visium Spatial Transcriptomics 技术。在第 7 天、第 3 周和第 8 周检查了三个 ovarian样本，它们代表了三个重要的 ovarian发育阶段。总体而言，使用统一流形近似（UMAP）和投影对九个转录不同的clusters进行分类和可视化。可以清楚地看到九个clusters的位置，伴随着follicle和黄体。然后，将时空数据与 scRNA-seq 数据相结合，使用 SPOTlight 推断复杂 ovarian组织内细胞类型和状态的位置（关于SPOTlight，大家可以参考文章10X空间转录组数据分析梳理、10X单细胞空间联合分析方法汇总及算法总结、10X单细胞空间分析回顾之SPOTlight）。如下所示，将八个明确识别的细胞类别映射到 10×Visium 时空 ovarian组织中，发现基质细胞、内皮细胞和 GC 是卵母细胞周围的三个细胞类别。可以看到 ovarian细胞类型的所有空间位置。

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Genetic dynamics signatures of the granulosa cell lineage during follicle development

颗粒细胞（GCs）是follicle中不可或缺的一部分，直接与卵母细胞相互作用。为了通过UMAP分析在调查期间剖析GC在发育过程中的异质性，将GC群体确定为11个clusters。为了获得基因特征的动态模式，鉴定了GC clusters特异性标记基因。根据这些分析，绘制了一个遗传动态模型，包括在follicle发育过程中的低分化、mural、卵丘、类固醇生成和增殖性 GC。已知在早期发育阶段 GC 中表达的基因是 Wt1 和 Foxl2；对于mural GC，Cyp19a1；对于卵丘细胞，Slc38a3 和 Amh；对于类固醇生成的 GC，Cyp11a1 和 Lhcgr。标记基因 Wt1、Slc38a3、Cyp19a1 和 Cyp11a1 在 10× Visium 切片中可视化，与真实的组织学位置相匹配。低分化GCs的比例随着时间的推移而降低，而卵丘GCs、mural GCs和类固醇GCs的比例随着时间的推移而增加，并在3周或8周达到峰值。结果与 ovarian和follicle发育过程中的 GC 动力学相匹配。然而，没有发现任何明显的边界来将原始follicle到窦follicle的 GC 分组。

为了剖析整个调查期间 GC 的命运决定，根据上面报道的基因表达，它们沿着伪时间轨迹排列。获得了三个状态（在伪时间分析中使用的术语，其中“state”被分配来标记 Monocle 中轨迹树的片段）。此外，代表基因（上面确定的 3 个follicle形成阶段的标记基因）的表达以及伪时间轨迹与我们的推断一致。根状态包含大部分差异较小的 GC；状态 1 包含大部分积云 GC、mural GC 和增殖 GC；状态 3 包含大多数类固醇生成 GC。在这样的伪时间轨迹中，3 个分支暗示了具有细胞标记的 GC 的 3 个分化阶段，例如 Wnt6、Wt1、Hmgb2 和 Cyp11a1。对这三个州的代表性基因的 GO 分析显示了相关的途径。此外，分析了两种主要细胞群（基质细胞和 GC）与其他细胞类型之间的细胞串扰。如下图所示，除了 GC 和其他细胞类型之间广泛的细胞间通讯外，基质细胞和其他 ovarian细胞类型之间的细胞间通讯也更强。

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Ovarian stromal cells are the main outgoing signaling cell type in ovarian cell communication during follicle development（ ovarian基质细胞是follicle发育过程中 ovarian细胞通讯的主要传出信号细胞类型）

为了分析这些细胞类型在小鼠 ovarian中的通讯，进一步进行了 CellChat 分析（关于CellChat，大家可以参考文章10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析之CellChat、10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析CellChat之多样本通讯差异分析），以确定follicle发育过程中这些细胞类型之间的细胞通讯。第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周的推断交互次数分别为 723、455、522、329 和 602，第 3 天的交互强度，第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周分别为 22.525、6.705、10.16、3.534 和 4.065。发现第 3 天、第 7 天和第 8 周是细胞通讯的最强时间点。因此，更多地关注第 3 天、第 7 天和第 8 周。ovarian中的九种细胞类型之间存在非常复杂的细胞通讯，而基质细胞是信号最强的细胞类型。进一步的信号传导作用分析表明，在六个重要的 ovarian发育时期，基质细胞在细胞间通讯中表现出最强的外向相互作用。 GCs 是在第 3、5 和 7 天接收最多传入受体信号的细胞类型，而上皮细胞是在 3 周和 8 周接收最多传入受体信号的类型。此外，在选定的时间过程中探索了特定类型的细胞通信。发现基质细胞经常与所有其他细胞交流。特别是，PTN、MK、ncWNT、PROS、GAS、ANGPTL 和 TWEAK 信号通路积极参与基质细胞的输出信号模式。在传出信号中，MK 在整个follicle发育阶段表达。 PTN 仅在第 3 天、第 5 天和第 7 天检测到，此时原始follicle激活和follicle发育为初级和次级follicle。比较了第 3 天和第 5 天，当原始follicle被激活时，发现 ncWnt、PROS、APELIN、GRN、CALCR、ACTIVIN、IFN-1 和 LIFR 在第 2 天特异性表达，而 IL -1 和 ANNEXIN 在第 5 天特异性表达。其他信号通路，如 TWEAK、PTN 和 MK，在第 5 天的表达水平高于第 5 天。当比较第 7 天和第 5 天的相对信息流时，发现IL-1、ANNEXIN、CCL、BMP、FGF 和 ENHO 在第 5 天特异性表达，而 TWEAK、APELIN、ANGPT、CALCR、CXCL、AMH、PERIOSTIN、PROS、EDN 和 MIF 在第 7 天特异性表达。其他信号通路，如 PTN 和 MK，在第 7 天的表达水平高于第 5 天。还将第 7 天的信号传导与第 3 周的信号传导进行比较，发现 PTN、TWEAK、EDN、MIF、TNF、WNT 、PERIOSTEIN、CXCL、CALCR、APELIN、IL-2和CSF在第7天特异性表达，而NPR2和HH在第3周特异性表达。这些细胞信号通路在特定follicle发育阶段发生变化，表明分泌信号可能有助于follicle发育阶段。由基质细胞分泌的 MK 等分泌因子随着follicle激活持续存在，直至follicle完全生长，这可能代表了基质细胞发送的支持follicle发育的重要信息。分析绘制了follicle发育中的关键信号通路。因此，follicle发育过程中这些细胞群之间的细胞通讯提供了更多关于follicle发育调控网络的信息。

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Identification and genetic dynamics of ovarian stromal cell subpopulations

此外，分析了 ovarian基质细胞的 genetic dynamics。当基质细胞的转录组与发育阶段一起绘制时，鉴定出 11 个细胞clusters。如前所述，鉴定了每个clusters内的新标记基因，其表达根据发育阶段而变化。 CytoTRACE 分析表明clusters 6、7 和 8 可能是基质细胞的root（关于CytoTrace，大家可以参考文章10X单细胞轨迹分析（拟时分析）之cytotrace）。对已识别clusters的特殊细胞标志物的特征图分析表明，Tcf21 在整个 ovarian基质中的表达最高，Lum 表达主要在cluster 0、1、2、4、5 和 10 中。 Star 和 Cyp17a1 主要在cluster 1 和 9 中表达，Enpep 主要在cluster 3、7 和 8 中表达，干细胞标记物 Aldh1a2 主要在cluster 6 中表达。基因 Lum、Cyp17a1、Enpep和 Aldh1a2 在 10× Visium 切片中可视化，并使用原位杂交 (ISH)、免疫组织化学 (IHC) 或免疫荧光 (IF) 进行验证。follicle周围基质细胞中的 Lum 表达支持follicle的生长。 Cyp17a1不仅位于follicle周围的膜细胞中，而且还位于膜外的一些基质细胞中。此外，Enpep 表达与follicle发育有关，并通过 ISH 得到证实。 Aldh1a2主要在 ovarian上皮和 ovarian皮质基质中表达。结果表明，ovarian基质细胞不是指单一的同质细胞群，可以借助 scRNA-seq 和空间转录组学方法进行明确分类。

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Fate transition of stromal cells along pseudotime trajectories and clear stromal cell classification

为了剖析整个研究期间基质细胞的命运决定，根据基因表达沿伪时间轨迹对它们进行排序。可以看到第3天、第5天和第7天的大部分细胞处于root状态，而基质细胞在第7天开始分化。这一发现表明第7天是基质细胞分化的时间点。细胞伪时间轨迹显示 5 个基质细胞状态和 2 个分支点。clusters 6 和 10 处于根状态的起点。结合 CytoTRACE 的结果和特定的细胞标志物进行综合分析，发现cluster 6 可能是基质细胞的祖细胞。该cluster的特征在于与生物过程相关的基因的表达，例如“PI3K-Akt 信号通路”、“粘着斑”和“内质网中的蛋白质加工”，这些基因在状态 1 细胞，表明基质细胞具有幼稚的典型功能。编码“脂质和动脉粥样硬化”、“MAPK 信号通路”和“FoxO 信号通路”成员的基因属于状态 3，证实了基质细胞中存在类固醇激素产生。状态 5 由编码参与“亨廷顿病”、“肌萎缩侧索硬化”和“氧化磷酸化”的蛋白质的基因组成，这表明这些基质细胞处于高功能状态。基因Ptn和Gstm6主要表达在状态1，Enpep主要表达在状态5，Star主要表达在状态 3。此外，鉴定出4个具有不同模式的基因组，4个基因组的特异代表基因，即 Sfrp1、Fhl2、Tmem100 和 Cebpb。

综合以上所有结果，将 ovarian基质细胞分为 4 个亚群：结构基质细胞、滤泡周基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞。 多模态交叉分析 (MIA) 也证实了 10× Visium 切片中基质细胞的分类。

为了进一步验证 ovarian基质细胞分类，在 E11.5 和 8 周之间的 11 个时间点对follicle和小鼠 ovarian周围的人 ovarian组织进行了分析。分析中包括具有直径为 2 mm 和 5 mm 的follicle的人类 ovarian组织。根据已知的细胞标志物， ovarian细胞可分为5个细胞亚群，基质细胞可分为6个clusters。ENPEP+ 滤泡周围基质细胞和 CYP17A1+ 类固醇生成基质细胞包围了人类follicle。然后，在 E11.5 和 1 天之间的六个时间点将数据与 ovarian整合，并确定了 11 种 ovarian细胞类型。在这些细胞类型中，基质细胞和 GC 也占人口的绝大多数。基质细胞分为 10 个cluster，大多数 Aldh1a2+ 基质祖细胞在 E11.5 和伪时间轨迹的根部出现。

Combining mouse and human single-cell data, the results confirmed our classification of ovarian stromal cells.

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Specific regulon networks of ovarian stromal cells during follicle development

为了更深入地了解上述四组细胞的功能，使用 SCENIC 进一步研究了基质细胞特异性 TF 的调节子（转录因子（TF））活性。在follicle发育过程中确定了几个重要的 TF。基于具有默认过滤参数的 5,481 个过滤基因的 51 个调节子活性，调节子活性与发育阶段相匹配，并列出了具有代表性的调节子。如图所示，一系列 TF 显示出更加动态的模式。例如，Maf、Wt1、Gata6 和 Erg1 主要在早期发育阶段活跃。随着follicle发育的继续，Foxo1、Runx1、Stat1 和 Smarca4 似乎主要在follicle成熟的 3 周和 8 周阶段被激活。由于基质细胞在第 7 天开始在细胞伪时间轨迹中分化成不同的命运，专注于这个时间点。 Yy1、Jdp2、Cebpb 和 Maff 主要在第 7 天活跃。Bclaf1 的调节子活性在第 7 天特别关闭。这些调节子活性模式可能为 ovarian基质细胞命运的确定提供新的见解。

此外，当将调节子活性与 ovarian基质细胞亚群联系起来时，发现一些 TF 显著代表特定的 ovarian基质细胞亚群。 Gata6 和 Wt1 主要在没有滤泡周围基质细胞的基质细胞亚群中活跃。 E2f1 和 Ezh2 主要在滤泡周基质细胞中活跃。 Maff 和 Irf1 等 TF 主要在类固醇基质细胞中活跃。 Irx3、Runx1 和 Smad3 主要在基质祖细胞亚群中活跃。

ovarian基质细胞的特定调节子网络的产生确定了与不同 ovarian基质细胞亚群相关的几个重要 TF，帮助研究人员在体外探索 ovarian基质细胞的命运。

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Stromal-derived MK coculture promotes follicle development

由于 MK 信号在整个follicle发育阶段表达，将 midkine 添加到与包裹在藻酸盐中的follicle共培养中，以进一步证实外向 ovarian基质细胞信号在follicle发育中的作用。 ovarian基质细胞是外向 MK 信号的主要来源，并且GC是主要目标。受体-配体分析表明，Ncl、Sdc4、(Itga6+ Itgb1) 和 Lrp1 是 MK 信号传导的主要贡献者。从第 3 天、第 5 天、第 7 天、第 3 周和第 8 周对小鼠 ovarian进行了 Mdk ISH 分析。Mdk 主要位于 ovarian基质中，在第 5 天小鼠 ovarian中表达最高。随着follicle的发育，Mdk表达主要发生在生长follicle周围的基质中，而在窦状follicle或黄体周围减少，表明它可能在follicle发育和成熟中起重要作用。然后研究了 Mdk 配体的表达和定位。 ISH和IHC均显示Ncl和Lrp1主要在生长follicle的GCs中表达。接下来，将纯化的 MK 添加到培养基中，以在体外与早期次级follicle共培养。结果表明，midkine 显著促进了follicle生长的增加。这些结果证实了 ovarian基质细胞与follicle的串扰作用促进了follicle的发育。

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Perifollicular stromal cells can differentiate into theca-like cells in vitro

为了研究基质细胞亚群在follicle发育中的作用，使用 ENPEP-PE 抗体通过流式细胞仪分选获得了follicle周围基质细胞。 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞比 ENPEP- 细胞更像成纤维细胞。免疫荧光分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞表达 ENPEP 和 COL1A1 但不表达 FOXL2。 ENPEP-细胞不表达 ENPEP 或 COL1A1 并且具有高水平的 FOXL2 表达。 qPCR 分析显示 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞具有较高水平的 Pdgfa、Enpep 和 Mdk，而较低水平的 Amhr2 和 Foxl2。在细胞培养过程中，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在传代到第三代 (P3) 时不能增殖，这表明 ENPEP+ 滤泡周围基质细胞可以在体外分化。膜细胞标志物 Star 和 Cyp17a1 的免疫荧光和 qPCR 分析证实，ENPEP+ 滤泡周围基质细胞在长期体外培养中分化为膜样细胞。结果揭示了 ovarian基质细胞类型分类的重要性。这些结果表明，滤泡周基质细胞不仅具有旁分泌作用，而且还具有分化功能。

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Discussion

ovarian和follicle发育在哺乳动物中是一个复杂的过程，要全面了解其调控需要整合从 ovarian中各种细胞类型收集的数据的多种类型和空间位置。在这里，对小鼠 ovarian内五个不同发育阶段（从原始follicle激活阶段到成熟follicle阶段，第 3 天到第 8 周）的所有细胞类型进行了 scRNA-seq 和空间转录组学分析，以提供新的和全面的见解进入小鼠 ovarian和follicle发育的调节。在这项研究中，鉴定了follicle的小生境细胞，例如基质细胞、GC、上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞。此外，分析揭示了每个发育阶段基质细胞与其他细胞类型之间的转录谱和细胞通讯的独特特征。此外，确定了四个以前未完全表征和分类的基质细胞clusters：结构基质细胞、滤泡周围基质细胞、基质祖细胞和类固醇基质细胞。结构性基质细胞分布在整个 ovarian中，主要执行支持功能。follicle周围基质细胞分布在生长的follicle周围，不仅通过分泌信号调节follicle发育，还可以分化和补充follicle细胞。基质祖细胞主要位于 ovarian皮质，是所有基质细胞类型的祖细胞。生成类固醇的基质细胞分布在 ovarian髓质中并合成类固醇激素。这些确定的细胞类型和 ovarian发育中特定阶段的基因表达为未来的功能研究提供了有价值的信息。

随着 scRNA 和空间转录组学技术的发展以补充详细的成像研究，有能力更好地表征 ovarian细胞群，并在了解它们在生理和病理过程中的个体作用时用更精确的名称来指代它们。以往关于follicle发育的研究大多集中在follicle体上，而忽略了基质细胞的功能。研究发现基质对follicle发育至关重要，仅关注follicle是远远不够的。 ovarian基质细胞亚群复杂，区域差异可能影响基质细胞的分布和亚型。多个 ovarian基质细胞群的特征不完全，但已经通过 scRNA 与空间转录组学技术的结合鉴定了四种类型的 ovarian基质细胞。单细胞 RNA 测序实验已经在识别主要 ovarian细胞类型、过渡阶段和细胞识别标记方面取得了进展。然而，在先前的研究中，关于 ovarian基质细胞的数据仍然难以捉摸并且相对稀缺。最近来自小鼠和人类的 scRNA 数据显示了 ovarian基质细胞的异质性，但这些研究主要集中在 GC 和卵母细胞上。单细胞测序无法提供细胞群的空间信息，导致 ovarian基质细胞的表征不完整。

follicle与支持的基质细胞保持接触，这些细胞提供了触发follicle生长激活的局部生化控制途径。基质到follicle旁分泌信号对follicle发育非常重要。为了探索 ovarian基质细胞和 ovarian其他细胞群之间的细胞间通讯，阐明基质细胞对follicle周围微环境的影响至关重要。在这项研究中，绘制了 ovarian内各种细胞类型之间的分泌信号网络，并揭示了 ovarian基质细胞作为主要外向分泌信号的作用。分析鉴定的分泌信号（如 MDK）为基质细胞在follicle微环境中的作用提供了新的见解。因此，通过将基质细胞整合到当前的三维培养系统中，可以显著增强共培养的影响。先前的研究还表明，由基质细胞表达的骨形态发生蛋白 BMP-4 和 BMP-7 与原始follicle向初级follicle的转变有关。这些过程中涉及的旁分泌信号被假设为未知因素的复杂的时间依赖性协同作用。

在这项研究中，发现了一个被生长的follicle包围并与膜细胞相邻的 ovarian基质细胞亚群，称为 ovarian滤泡周基质细胞。 ovarian滤泡周基质细胞不仅可以发送分泌信号（如 MDK），还可以分化成类固醇基质细胞，表达膜细胞标志物 Star 和 Cyp17a1。研究结果支持膜细胞是从周围的基质细胞中募集的，并确定了一种特殊的基质细胞亚群。膜细胞在follicle发生过程中发挥多种必要作用；它们合成雄激素，在发育过程中提供与 GC 和卵母细胞的串扰，并在发育阶段为生长中的follicle提供结构支持，以产生成熟且可受精的卵母细胞。以前认为，膜细胞是通过激活的初级follicle分泌的因子从周围的基质组织中募集的。这些招募因素的确切来源和身份目前尚不清楚。长期以来，人们一直认为这些特化细胞起源于成纤维细胞样基质细胞。推定的未分化祖细胞膜不表达 LH 受体 (LHR) 或类固醇生成酶，因此对 LH 没有反应，这表明膜细胞分化的起始是促性腺激素独立的。最近，研究还表明，鞘干细胞的自体移植可恢复非人灵长类动物的 ovarian功能。使用的鞘干细胞是总 ovarian基质细胞，而不是单细胞群。研究通过细胞分选鉴定并获得了功能性滤泡周围基质细胞，这些细胞可以分化成膜细胞。这一发现为 ovarian早衰（POI）干细胞疗法的发展提供了新的思路。

假设基质细胞来自一群非特化的间充质干细胞，但它们的起源和生理作用仍然难以捉摸，需要更多令人信服的数据。已经确定Aldh1a2是 ovarian基质祖细胞的标记基因，主要在 ovarian表面上皮细胞和 ovarian皮质基质细胞中表达。 Aldh1a2+ ovarian基质祖细胞主要处于假时间轨迹中基质细胞发育的起源。还注意到，随着时间的推移，Aldh1a2+ ovarian基质祖细胞数量减少，这表明 ovarian功能的衰减不仅是follicle池的下降，而且是 ovarian基质祖细胞的下降。醛脱氢酶 1 (ALDH1) 是正常组织干细胞的标志物，参与自我更新、分化和自我保护。研究表明， ovarian表面上皮细胞和亚表面区域中表达 Aldh1a1 和 Aldh1a2 的干细胞niche。

ovarian间质异常是许多临床 ovarian功能障碍疾病的重要原因，如多囊 ovarian综合征（PCOS）。 PCOS是女性常见的内分泌疾病，其特征是排卵过少或无排卵、雄激素过多症和 ovarian多囊症。 PCOS患者 ovarian可见皮质增厚、间质增生和囊状窦follicle，伴有 ovarian体积、间质体积显著增加，间质血流速度加快。超排卵治疗挽救了异常的基质形态，导致一些 PCOS 患者获得了成熟的卵母细胞。基质细胞异常是PCOS的一个重要原因，但机制尚不清楚。血管生成素样蛋白 (Angptl-4) 和 TWEAK11 被认为与 PCOS 的发病机制有关，并且是 ovarian基质细胞与其他细胞类型通讯的两个主要信号通路。此外，研究表明， ovarian滤泡周围的基质细胞与follicle一起生长，可以分化成膜样细胞；因此，PCOS中基质异常的原因可能是 ovarian滤泡周围基质细胞功能障碍。 ovarian滤泡周围基质细胞的异常增殖可导致基质增生，增加向膜样类固醇生成基质细胞的分化可导致高雄激素血症。因此，对 ovarian滤泡周基质细胞的分类为 PCOS 的发生和治疗提供了新的见解。

In summary, this work provides new insights into the crucial features of mouse follicle development, especially stromal cells. Our study paves the way for understanding the molecular regulation of ovarian stromal cells in follicle development. It also lays a solid foundation for ovarian stromal cell classification and origin identity. We obtained functional perifollicular stromal cells and identified the vital secreted factors that promote follicle development in vivo and in vitro. More importantly, we have uncovered the reciprocal relationship between the signaling pathways of follicles and their niche cells, which will provide a valuable resource for further optimizing and improving the efficiency of follicle culture in vitro. Our understanding of stromal cell subpopulations will help us better understand stromal cell hormone production and responsiveness, pathological ovarian stromal changes, such as polycystic ovary syndrome or premature ovarian insufficiency, and stromal contributions to artificial ovary technology.

Method（关注一些重点方法）

• 单细胞空间联合 ---- SPOTlight

• 轨迹分析 ---- CytoTRACE 、monocle2

• 基因调控网络 ---- SCENIC

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