LONZA电转标准SOP流程
2024-05-05 本文已影响0人
谢俊飞
试剂盒：SE Cell Line 96-well Nucleofector™ Kit
- 2.25 mL SE Cell Line NucleofectorTM Solution
- 0.5 mL Supplement 1
- 50 µg pmaxGFPTM Vector (1 μg/μl in 10 mM Tris pH 8.0)
- 1 x 96-well NucleocuvetteTM Plate (20 μL)
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有关Nucleofection样品含量和推荐的Nucleofector程序，请参见表3。
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1. 请确保将整个supplement添加到 Nucleofector™ Solution中；
2. 启动 4D-Nucleofector™ 系统并创建或上传实验参数文件（详见设备手册）;
3. 选择/检查适当的 Nucleofector™ 程序（见表 3）;
4. 准备细胞培养皿，在适当孔数的培养皿中注入所需体积的推荐培养基（见表 4），并在37°C/5% CO2 加湿培养箱中对培养皿进行预培养/平衡;
注：注意保温，小体积培养基在台内冷却降温较快。
5. 将等分的培养基预热至 37°C（见表 4）;
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6. 制备质粒DNA或pmaxGFP™ 载体或siRNA（见表 3）;
7. 用胰蛋白酶法收获细胞（见 1.6-1.8）;
8. 对等分的细胞进行计数并确定细胞密度;
9. 将所需数量的细胞（见表 3）在室温下以90g 离心10分钟，彻底清除上清液;
注：先用大量程移液器缓慢吸走大部分上清液，然后再短暂离心后，用小量程移液器吸走残留的液体。
10. 用室温 4D Nucleofector™ Solution（见表 3）小心重悬细胞团;
注：将细胞长时间留在Nucleofector™ Solution中可能会导致转染效率和生存能力降低，因此尽快完成工作非常重要。移液时避免产生气泡。
11. 配制母液：根据底物的数量将细胞悬浮液分成几等份；
12. 在每个等分样品中加入所需数量的底物（最多为最终样品体积的 10%）;
注：每个样品中加入底物溶液的体积不应超过总反应体积的10%。
若样品较多，可先配制好所需量的质粒于PCR管中，随后将Nucleofector™ Solution/细胞悬液加入到对应的PCR管中，吹打混匀立即转移至电转杯中。
13. 将mastermix转移到Nucleocuvette™ Vessels中;
14. 轻轻敲击 Nucleocuvette™ Vessels，确保样品覆盖电转杯底部。
15. 将盖好盖子的 Nucleocuvette™ Vessels放入 4D-Nucleofector™ X 装置的固定器中。检查 Nucleocuvette™ 容器的方向是否正确；
16. 按下 4D-Nucleofector™ 核心部件显示屏上的 "Start"（开始）按钮，启动 Nucleofection™ 程序（详情请参见设备手册）；
17. 运行完成后，小心地从固定器上取下 Nucleocuvette™ Vessels；
18. 用预热培养基重悬细胞（建议用量见表 5）。上下轻轻吹打2-3次以混合细胞。使用 100 μl Nucleocuvette™ 时，请使用随附的移液管，避免反复吸入样品。
注：用50mL离心管盛放预热的培养基，一次性加满所有的电转杯孔；
19. 将所需数量的细胞培养到您选择的培养系统中（推荐体积见表 5）。
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综合：
Ø 电转前细胞培养2-3天，汇合度80-90%；
Ø 细胞所有操作要快（换液、离心、加样、重悬、电转……）；
Ø 电转底物（质粒）体积要少；
Ø 细胞/电转液混合物不能有气泡；
Ø 细胞不宜脱离培养基太久；
Ø 电转后用热培养基孵育；
Lonza电转技术专家为大家总结了以下几点：
- 准备好加了新鲜培养基的多孔板，并在实验前于37°C下预平衡；
- 使用传代次数少并具有推荐融合度或密度（对数生长期）的细胞；
- 针对于贴壁细胞，需限制胰蛋白酶暴露时间，仔细监测细胞分离情况；
- 根据优化方案进行细胞计数并使用适量细胞数；所用细胞过少可能导致细胞死亡率增加，所用细胞过多可能导致细胞电转效率降低；
- 采用高质量DNA，使用内毒素去除试剂盒进行纯化；请通过测定A260:A280比值检查各质粒制备液的纯度；
- 室温下以离心速度80-100×g和方案规定的时间进行离心；
- 离心后加入Nucleofector™溶液，混匀溶液/细胞沉淀制备成单细胞悬液，避免对细胞沉淀进行额外操作或用移液器枪头重复抽吸；
- Nucleofection™核转后，用核转试剂盒内配的一次性移液管在电转耗材中的细胞顶部加入约500μL预热培养基；
- 轻轻将一次性移液管吸头置于电转耗材底部，收集细胞；
- 将细胞悬液轻轻接种至制备的多孔板中；
请勿重复吹吸混合细胞
