DNA上动“手术”——神奇的CRISPR - Cas9 技术（上

简介

CRISPR - Cas 是细菌长期进化形成的适应性免疫系统。当外源病毒 DNA 首次进入细菌，专门的 Cas 蛋白在外源的 DNA 中，“择要”剪成小片段，并将它粘贴到自己 DNA 相关部位——CRISPR 序列中。然后，由自身 DNA 表达的相关 Cas 蛋白们，分几步加工 CRISPR（由DNA形式），产生 CRISPR RNA（crRNA）。最后，含 Cas9 的复合物，依 crRNA 为模板，在外源病毒（第二次入侵及更多次）的 DNA 上进行匹配搜索。一旦发现相同的 DNA 序列，即切割目标 DNA 以消除外来病毒的威胁。

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目录（全）

一、引言
二、发现 CRISPR - Cas9 历程
三、CRISPR - Cas9 工作原理
四、运用 CRISPR - Cas9 实现精准基因编辑
五、CRISPR - Cas9 实现技术

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DNA上动“手术”——神奇的CRISPR - Cas9 技术（中）
六、《解码者》——詹妮弗・杜德纳传记
七、学习运用 CRISPR- Cas9 系统
八、让基因剪刀修改人类细胞基因

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DNA上动“手术”——神奇的CRISPR - Cas9 技术（下）
九、CRISPR - Cas9 技术应用领域
十、CRISPR - Cas9 技术挑战与争议
十一、CRISPR - Cas9 技术未来展望
十二、参考文献

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一、引言

在生命科学这个浩瀚的宇宙中，基因编辑技术就像星空中闪耀的群星。闪烁着的光芒，指引人类探索生命奥秘、治疗疑难病症，改良生物品种的前进路途。而在这一大群基因编辑技术里，CRISPR - Cas9 技术是最近闪现的新星！它以精准、高效，容易操作特点，一下就席卷了整个生命科学领域，掀起了一场前所未有的技术风暴！

之前，人类对生物遗传物质 DNA 的干预，均通过物理（如高能射线）、化学（芥子气、溴化乙锭）和太空环境（微重力与宇宙射线），包括生物诱变等手段，让 DNA 发生不可预控的随机突变，来探索生物基因功能或创造新性状。

表 1: 诱发 DNA 随机突变的类型、特点和应用

诱变类型	突变特点	典型应用	局限性
物理诱变	随机断裂、大片段缺失	作物育种、肿瘤模型构建	突变谱窄，需严格防护
化学诱变	点突变、小片段插入或缺失	基因功能研究、药物靶点筛选	毒性高，需专业处理
太空诱变	复杂重排、多基因协同突变	太空育种、极端环境适应性研究	成本高，难以控制突变方向
生物诱变	插入突变、基因水平转移	基因治疗载体开发、合成生物学	整合位点随机，存在安全风险

然而， CRISPR - Cas9 技术——能以“指那打那”的精准度——在 DNA 上动“手术”，从而，在细胞内对基因进行精准“敲除”或“更换”，在医学临床中对疑难遗传疾病进行挑战，在农业生物领域里培育各种各类优异品种，其技术应用范围之广，影响之大，效果之好，简直一骑绝尘！

它不仅给基础科学研究带来了天翻地覆的变化，让科学家们能够用前所未有的精度和效率去解开基因的秘密和生命的谜团，还为医学、农业等众多领域带来了无限希望和无穷可能，进而从根本上改变人类的当下和未来的生活！

接下来，让我们一起深入探索 CRISPR - Cas9 技术的原理、实现技术，还有它在各个领域的应用，感受这个神奇技术的独特魅力！

二、发现 CRISPR - Cas9 历程

（一）细菌神秘防御机制初现端倪

CRISPR - Cas9 系统的发现，还得从科学家对细菌体内一些奇特现象的观察说起。在漫长的进化过程中，就像人类一直防备细菌侵袭捣乱一样，细菌也整天面临各种病毒的疯狂攻击。不过，细菌自己发展出了一套超级独特、绝对巧妙的防御机制，就像给自己穿上一层坚固的铠甲，抵御那些讨厌的入侵者。

1987 年，日本微生物学家石野良纯，在研究大肠杆菌的时候，偶然发现这个细菌的 DNA 基因组里有一段特别奇怪的重复序列。这段序列就像是由一“正”一“背”的麻将牌排列而成的长龙，由多个短短的“重复片段”和“间隔区域”交替排列组成。当时他并不知道这段序列到底有啥用，能干啥。

随着科学家不断研究和探索，越来越多的人在不同种类的细菌和古细菌中都发现了类似的重复序列。后来，这些重复序列被正式命名为 “成簇的规律间隔短回文重复序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）”，简单点，就叫 CRISPR。

（二）关键蛋白 Cas9 的发现

到了 2005 年，科学家们已经掌握了来自 60 多种细菌中多达 4500 段 CRISPR 序列。这时候，他们开始对比这些序列的相同点。一对比就发现了秘密！有 88 段 DNA 居然在不同细菌中出现了好多次！更神奇的是，88 段里还有 47 个和许多病毒的基因组序列信息特别像，简直就是“双胞胎”！

科学家敏锐地猜测，这些序列和细菌抵御病毒的能力之间是否有什么联系。接着，他们又进一步研究，发现在 CRISPR 序列附近，还有一些和它相关的基因。这些基因编码形成的蛋白质统称为与 CRISPR 相关蛋白（Cas 蛋白）。其中，Cas9 蛋白一下子就成了研究的焦点。科学家们慢慢意识到，这个 Cas9 蛋白说不定就是细菌用来对抗病毒的“秘密武器”，就像孙悟空手中的如意金箍棒一样！

（三）发现细菌防御病毒的机理

2012 年，对于 CRISPR - Cas9 技术来说，是具有里程碑意义的一年！美国加利福尼亚大学伯克利分校的詹妮弗・杜德纳（Jennifer Doudna）和瑞典于默奥大学的埃玛纽埃勒・沙尔庞捷（Emmanuelle Charpentier）一起完成了一项开创性研究。

她们深入分析，终于解开了 CRISPR - Cas9 系统的作用机制。原来，这个系统像一把锋利的剪刀一样，能精准地切断特定的 DNA 序列。

沙尔庞捷 对 CRISPR 序列有着非凡的兴趣。那年，她的实验室正在研究一种危险的人类致病细菌——化脓链球菌——里的 CRISPR 序列。她发现，细菌里有一种 Cas 蛋白（就是大名鼎鼎的 Cas9，当时叫 Csn1）和两段 RNA 分子，可以精准地识别和切断进入细菌体内病毒的 DNA！

杜德纳 是研究生物大分子结构方面功成名就享誉业内的著名专家——尤其是在 RNA 和蛋白质的结构和功能方面。2011 年，在美丽的波多黎各一场由美国微生物学会组织的会议上，沙尔庞捷把她实验室的结果告诉了杜德纳，并提议她研究一下 Cas9 蛋白质的结构，以及它到底是怎么发挥作用的。

两个相隔万里，被大西洋分开的实验室马上展开精诚合作。仅仅一年后—— 2012 年，以及2014年，她们就以 0.25 纳米分辨率的精度，完美地揭开并精确地阐释了 CRISPR - Cas9 系统的工作原理。（要知道，DNA 双链的直径居然“粗”达 2 纳米。）

可以把 Cas9 蛋白想象成某种具有两个卡槽的神奇装置。在这个装置里，两个卡槽分别插进一条 CRISPR 向导 RNA 和一条病毒基因组 DNA。当插入的 CRISPR 向导 RNA 和移进来的病毒 DNA 序列就像中国古代调兵的虎符一样，能精准配对时，Cas9 蛋白就会像变形金刚一样发生变形，准确地卡住病毒 DNA，然后“咔嚓”一声，毫不犹豫地把它剪断。

这就是细菌免疫系统的工作原理：一个自带切割功能的蛋白质 Cas9，一段自带识别功能的 RNA。

图 1: CRISPR - Cas9 系统工作原理

（当 Cas9 蛋白带着来自 CRISPR 的向导 RNA（gRNA） 在细胞里“巡逻”时，一旦发现进入的那段 DNA（Fremd-DNA） 序列能和向导 RNA 完美匹配，并且通过 PAM 识别出这是“非我族类”的外来物，就会激活 Cas9 蛋白，实现对 DNA 的切割。）

这一发现就像一个超级台风，在基因编辑领域中掀起翻天巨浪。因为它给科学家们提供了一种全新的、超级高效的基因编辑工具。

各个研究机构迅速跟进，证明 CRISPR - Cas9 技术不仅能在体外实验室和原核细胞里发挥作用，还能在小鼠和人类等的真核细胞内的基因组编辑中大展身手。从那以后，CRISPR - Cas9 技术就在生命科学领域全面开启了它的辉煌之旅。

时隔 8 年的 2020 年，埃玛纽埃勒・沙尔庞捷和詹妮弗・杜德纳两人，因为在 CRISPR - Cas9 工作原理和技术开发方面的杰出贡献，获得了诺贝尔化学奖。要知道，从发表科研结果到拿到诺贝尔奖，时间间隔得如此之短，不仅是对她们杰出科研成就的高度认可，也标志 CRISPR - Cas9 技术在科学界的重要地位和所得到的广泛应用。

图 2: 2020 年诺贝尔化学奖获得者：埃玛纽埃勒・沙尔庞捷和詹妮弗・杜德纳

三、CRISPR - Cas9 工作原理

（一）系统的组成部分

• CRISPR 序列：CRISPR 序列是 CRISPR - Cas9 系统的核心成员！它由一系列短短的“重复序列”和“间隔序列”交替排列组成。这种 “重复序列 — 间隔序列 — 重复序列 — 间隔序列” 的交替排列，就好像是用相同的分隔符号（重复序列）把不同的有用信息（间隔序列）隔开一样。比如说，在大肠杆菌的 CRISPR 系统中，重复序列长度大概是 29 - 32 个碱基对，间隔序列长度大概是 32 - 38 个碱基对。这种有规律的排列让整个 CRISPR 序列的结构看起来特别清晰，像是一幅整齐划一的拼图。

• Cas 蛋白家族：Cas 蛋白家族是 CRISPR - Cas9 系统的重要组成部分，其中的Cas9 蛋白更是当之无愧的关键成员——就像球队里的超级明星。Cas9 蛋白有一项超级厉害的本领，就是它具有的核酸酶活性，能像一把锋利的小剪刀，对 DNA 长链进行切割。除了 Cas9 蛋白之外，还有其他 Cas 蛋白，在 CRISPR 系统工作的不同阶段，发挥重要且独特作用。比如说，Cas1 和 Cas2 蛋白就参与了间隔序列的获取过程，它们像勤劳小蜜蜂一样，帮助细菌把外来病毒的 DNA 片段“采集整合”到自身基因组的 CRISPR 序列中。

表 2: Cas 蛋白家族成员的结构特性和功能应用

Cas 蛋白分类	核心结构域	靶向核酸类型	关键功能	典型应用
Cas1/Cas2	核酸酶结构域（Cas1）、辅助结构域（Cas2）	DNA	收集并整合病毒 DNA 片段到 CRISPR 序列中	研究 CRISPR 系统进化
Cas9	HNH 结构域、RuvC-like 结构域、PAM 识别域	DNA	切割双链 DNA（依赖gRNA）	基因编辑（如遗传病治疗）
Cas12	RuvC-like 结构域	DNA	切割双链 DNA，附带切割单链 DNA	核酸检测、基因编辑
Cas13	HEPN 结构域	RNA	切割双链 RNA，附带切割单链 RNA	RNA 编辑、RNA 病毒检测
Cas6	RNA 酶结构域	RNA	加工 pre-crRNA 为成熟 crRNA	向导 RNA 的制备

（二）CRISPR - Cas9 防御病毒机理

CRISPR - Cas9 系统就像是细菌在和病毒，进行一场“魔高一尺、道高一丈”长期军备竞赛后，进化出来的超级免疫系统。它的防御过程特别像人类的“疫苗接种”，先“记住”入侵者的特征，等下次入侵者真正到来的时候，就精准地把它们“清除”掉。

这个过程分成“适应—表达—干扰”三个核心阶段，这三个阶段就像三个紧密相连的小齿轮，环环相扣，形成了一个完整的防御链条。

第一阶段：适应——“记录”入侵者DNA片段，形成“病毒样本库”

当病毒第一次进入细菌的时候，比如由噬菌体入侵带入，细菌就会启动它的“记忆存档”流程——就像我们把重要的文件存到电脑里一样——把入侵者的特征片段整合到自身基因组中，为下阶段防御作战做好充分的先期准备。

图 3: 适应阶段

• 识别与切割：入侵病毒的 DNA 进入细菌后，Cas1 和 Cas2 蛋白就会像超级侦探一样，识别其中的特异性序列（通常是病毒基因组中不容易发生突变的保守区域），然后把它切割成短片段（大概 20 - 40 个碱基），这些片段就被叫做“间隔序列”。不过，在进行切割之前，Cas1 - Cas2 复合体还得先做两件事。一，先在外来病毒基因组中寻找一个特殊的 PAM 序列（Protospacer Adjacent Motif，前间区邻近基序），这个 PAM 序列像是入侵病毒的“分子身份证”。二，Cas1 - Cas2 复合体把此时“擒获”的候选病毒DNA，与 CRISPR 阵列转录出的成熟 crRNA（见后阐述）进行快速互补比对。若 100 % 匹配，则 crRNA 与 DNA 形成稳定双链，Cas1 - Cas2 复合体认定此段 DNA 早已储存在 CRISPR 阵列中，于是释放这段 DNA，开始新的扫描。这一步无需额外能量（意味绝不“纠缠不休”，“好聚好散”），可在毫秒内高速完成，被称为“整合前校对”。如果病毒 DNA 片段，不能与 crRNA 完全匹配，复合体将以 PAM 为定位标志，从病毒的 DNA 上精准地“摘下”这段有效片段（但不包含 PAM 序列）。

• 整合到 CRISPR 序列：随后，Cas1 - Cas2 复合体把切割后的间隔序列插入细菌自身基因组的 CRISPR 序列中。CRISPR 序列的结构很特别，是由重复序列（来自细菌内源的“保守序列”）和间隔序列（来自病毒外侵的“记忆片段”）交替排列组成的。新的间隔序列将会插在 CRISPR 序列的前端，形成一种“最新记忆优先”的存档模式，就像我们把最新的照片放在相册最前面一样。插入时，先把重复序列的两条 DNA 链分别在头尾处断开，后把新“摘下”间隔序列 DNA 的双链，一条接在头部，另一条接在尾部。之后，由 DNA 修复机制补全重复序列，形成新的完整的 CRISPR 序列。（见图3。另：和后面的图4、图5，均来自《关于CRISPR系统的讲解》。在此致谢！）

• 意义：这一步相当于为细菌“接种疫苗”。通过保存病毒的 DNA 片段，让细菌自己和它的后代都能识别同一类入侵者。

第二阶段：表达——“激活”防御武器，合成“导航—切割”工具

当同一病毒再次入侵的时候，细菌就会调用 CRISPR 序列中的“记忆”，合成用于精准反击的分子工具，就像士兵们接到命令后，赶紧拿出自己的武器一样。

图 4: 激活阶段

• 先由 CRISPR（DNA状） 转录产生前体 RNA（pre-crRNA）：在这个过程中，细菌会转录整个 CRISPR 序列，产生包含全部重复序列和间隔序列的 RNA，称为 pre-crRNA，就像复印一份包含所有信息的文件一样。

• 加工合格成熟的 crRNA：pre-crRNA 会和另一种 RNA（tracrRNA，反式激活 crRNA）结合在一起（因为 tracrRNA 和 pre-crRNA 中的重复序列是互补的，就像两块拼图能互相镶合一样），形成一个长长的节状复合体。之后，Cas9 蛋白辨识tracrRNA，并与之结合，形成一条含有多个膨胀节点（crRNA + tracrRNA + Cas9 蛋白）的“项链”状复合体。此时，细胞会“召集” RNase III （存在于原核和真核生物中的双链 RNA 切割酶）前来，对这个复合体进行切割。通过切割，把“项链”状复合体分开，加工成一颗颗含有 crRNA 的最终产品（合格的 crRNA 只包含一个间隔序列（病毒样本）和部分重复序列）。

• 形成 Cas9-crRNA-tracrRNA 复合体：合格的 crRNA 因为带有间隔序列内容，所以就“记住”了病毒 DNA 的特征。而 tracrRNA 除了具有互补功能可与 crRNA 结合外，还另有一个重要性能，像一个“钩子”，负责把一段 crRNA 和一个 Cas9 蛋白连接起来。这样“三位一体”，形成了一个能在细胞内四处巡游的“导航体”（gRNA = crRNA + tracrRNA ）和切割器（Cas9）的功能复合体。此时出击“武器”已经准备就绪了！（见图 4）

• 意义：经由 Cas9 和 RNase III 蛋白等，对 CRISPR 的转录体进行复杂加工，形成具备 “导航 - 切割” 功能的复合体，就如带有识别功能的巡航导弹一样，作为精准反击病毒的武器。

第三阶段：干扰——“精准打击”，摧毁入侵病毒的 DNA

这是防御过程的最后阶段，就像一场战斗的决战一样，复合体依赖自带的双重识别机制，不但清除了入侵者，而且避免误伤细菌自身的基因组。

图 5: 干扰阶段

• 定位目标病毒的DNA：各个 Cas9 - crRNA - tracrRNA 复合体，时时刻刻都在细胞体内扫描各条 DNA 。在此过程中，Cas9 蛋白会尝试识别目标 DNA 上的 PAM 序列（PAM 现时作为敌我识别器）——而这是病毒 DNA 特有的“标记”。一旦发现含有 PAM 序列的DNA，即刻把此段 DNA 的上游双链解旋，然后 crRNA 会“扑在”在此段 DNA 上“搜寻”和它互补的序列。

• 切割病毒DNA：当 crRNA 和病毒 DNA 的互补序列配对成功，而且 PAM 也被识别出来了——这种双重识别验证就保证这一段 DNA 是外来病毒的，而不是自身 CRISPR 序列中的。这时候，Cas9 内的两个核酸酶结构域（HNH 和 RuvC）就会像两个默契的小助手一样协同作用，分别切割病毒 DNA 的两条链，让它断裂。

• 瓦解入侵：断裂后的病毒 DNA 既没办法进行正常复制，也不能被整合进细菌的基因组中，最后会被细菌内的核酸酶降解掉。这样一来，阻止了病毒的繁殖，保护了细菌自身的存活，取得了消灭“侵略者”的完全胜利。（见图 5）

• 意义： 依 crRNA 样本搜寻，由 Cas9 识别 PAM，双重验证锁定 DNA 来自病毒。再经 Cas9 核酸酶结构域切割其双链，使病毒DNA无法复制，并被降解。结果是完美地抵御了入侵病毒。

总结：从“记忆”到“反击”的完美闭环防御

CRISPR - Cas9 系统的防御机制就是细菌对病毒入侵的“适应性免疫应答”：“适应阶段”通过整合间隔序列，建立一个病毒样本库；“表达阶段”合成特异性的攻击武器，就像制造自动寻的巡航导弹；“干扰阶段”依赖精准识别实现定点切割，就像精准地击毁目标。这一机制的核心是“特异记忆”与“双重验证（crRNA 互补 + PAM 识别）”，既保证了对入侵者的高效清除，又避免了对自身基因组的误伤。

四、运用 CRISPR - Cas9 实现精准基因编辑

就像诺贝尔获得者詹妮弗・杜德纳所说的那样：“科学研究，受着两种动机的驱使：阐明未曾探索的自然现象，以及把这些知识付诸实用。”仅仅探得 CRISPR - Cas9 系统的工作原理，只是属于科学发现领域；进而把这些知识实用，却是技术领域的另一重天地。

不用说也知道，细菌这种高效又可控的防御病毒机制，给科学家们的基因编辑技术带来的灵感，显然就像一条通衢大道突然从迷雾中显现。

（一）设计向导 RNA（gRNA）

要是想用 CRISPR - Cas9 技术进行基因编辑，首先得根据目标基因的序列设计一段向导 RNA（gRNA）。gRNA 是一段由人工合成具有魔法的 RNA 分子，它包含两个重要的部分：一部分是和目标基因互补的序列，这部分序列就像是给 Cas9 蛋白“剪刀”指明地点，决定了它将要切割 DNA 的位置；另一部分是和 Cas9 蛋白结合的“黏贴”序列，它能确保 gRNA 可以和 Cas9 蛋白形成一个稳定的复合物。前者类似 crRNA 功能，后者类似 tracrRNA 功能。

通过设计不同的 gRNA 分子，科学家们就可以引导 Cas9 蛋白精确地切割那些被指定的基因序列，就像给 Cas9 蛋白配备了一个精准的 GPS 导航器，以实现对基因的定点编辑。

（二）切割目标 DNA

先把设计好的特定 gRNA 和与之配合工作的 Cas9 蛋白，一起导入细胞中。进入细胞后，gRNA 就像一个导游一样“按图索骥”，引导 Cas9 蛋白找到目标基因的特定位置。当 Cas9 - gRNA 复合物识别到和 gRNA 互补的 DNA 序列时，Cas9 蛋白就会发挥它核酸酶的剪刀功能，对目标 DNA 的双链进行切割，让双链断裂，就像剪断一根项链一样。

（三）细胞的修复机制与基因编辑结果

细胞在面对 DNA 双链断裂的危机时刻，会启动自身的应急修复机制，就像我们受伤了会自动愈合一样，来修复断裂的 DNA。细胞内主要有两种修复机制：非同源末端连接（NHEJ）和同源定向修复（HDR）。

• 非同源末端连接（NHEJ）：NHEJ 是一种比较简单又快速的修复方式，它不需要模板，直接把断裂的 DNA 两端连接起来。不过这种修复方式不太精确，在连接的过程中经常会引入一些碱基的插入或缺失，导致基因序列发生改变，就像在一篇文章里随意添加或删除了一些字，从而使基因功能丧失或改变。科学家们就是利用 NHEJ 这种容易出错的修复机制，来实现特定基因的敲除。比如说，通过引入随机的碱基插入或缺失，破坏目标基因的原本编码序列，让它再也无法正常表达蛋白质，这样原有功能就被废弃了，就像把一台机器的关键零件弄坏了，让它没法正常工作一样。

• 同源定向修复（HDR）：HDR 是一种相对精确的修复方式，它需要一段和断裂 DNA 两端序列同源的模板 DNA。在修复过程中，细胞会以这段模板的 DNA 为指导，准确地修复断裂的 DNA。利用 HDR 机制，科学家们不但可以实现基因敲除，还能按照自己的要求进行替换。比如说，可以把一段含有特定基因的 DNA 片段作为模板，和 Cas9 - gRNA 复合物一起导入细胞中。当 Cas9 蛋白切割目标基因产生双链断裂的那一瞬间，细胞就会把和目标基因部分同源但已经内含特定修饰的 DNA 片段作为模板，对目标基因进行修复操作，从而实现基因的替换，就像把一个旧零件替换成一个新零件一样。

• 用 “项链修补” 理解基因编辑的替换：假设一段 DNA 是 “...ABCDEFG...”，目标是把其中的 “CDE” 替换成 “XYZ”。第一，切割：Cas9 在 “B” 和 “C” 之间剪一刀，DNA 就断成了 “...AB” 和 “CDEFG...” 两段，就像把项链从中间剪断一样。第二，模板设计：设计的同源模板为 “ABXYZFG”（左臂 “AB” 和左侧断裂端互补，右臂 “FG” 和右侧断裂端互补，中间是替换序列 “XYZ”），就像准备一个新的项链片段。第三，修复：修复后的 DNA 变成了 “...ABXYZFG...”，原本的 “CDE” 被 “XYZ” 替换。全程只切割了一次，修复成功后的 DNA 是断裂后两段的重组。这就像把剪断的项链重新接好，还换了一部分珠子一样。

五、CRISPR - Cas9 实现技术

（一）载体构建

1. 常用载体类型：要是想把 CRISPR - Cas9 系统导入细胞进行基因编辑，就得借助载体来帮忙，就像我们要过河得坐船一样。常用的载体类型有质粒载体、病毒载体等。

• 质粒载体：质粒是一种小小的环状双链 DNA 分子，在细菌里到处都是。质粒载体的优点较多，结构很简单，操作很容易，还能在细菌中大量复制。构建 CRISPR - Cas9 质粒载体的时候，通常要把编码 Cas9 蛋白的基因和 gRNA 的基因克隆到同一个质粒中。这个载体可以通过化学转染（转染的含义见后）、电穿孔等方法导入细胞中。不过，质粒载体的转染效率相对比较低，对于一些很难转染的细胞类型，效果不太好，就像一辆车在有些路上开得很慢一样。

• 病毒载体：病毒载体是利用病毒的感染特性，把目的基因导入细胞的一种载体系统。常用的病毒载体有慢病毒载体、腺相关病毒载体等。慢病毒载体就像是一辆“基因快递车”，它保留了病毒“穿透细胞膜”的能力，但是去掉了“致病因素”。比如改造后已“脱毒”的安全版 HIV - 1 病毒，它可以把携带的基因稳定地整合到宿主细胞的基因组中，实现基因的长期表达。腺相关病毒载体（天然腺病毒本来就不会引发人类疾病，改造后又进一步删除了潜在风险基因，几乎没有插入突变风险）则具有安全性高、免疫原性低等优点。腺相关病毒载体的转染效率比较高，能够有效地把 CRISPR - Cas9 系统导入到多种细胞类型中，包括一些很难转染的原代细胞和干细胞。不过，腺相关病毒载体的构建过程相对比较复杂，需要专业的技术和设备，就像造一辆超级复杂的跑车一样。

2. 载体构建流程：以质粒载体为例，看看构建 CRISPR - Cas9 质粒载体的一般流程：

• 选择合适的质粒骨架：根据实验的需求，选择一个具有合适的抗性基因、复制起始位点等元件的质粒骨架，就像选一个合适的房子框架一样。

• 克隆 Cas9 基因：从已有的 Cas9 基因表达载体中扩增出大量 Cas9 基因，然后把它克隆到选定的质粒骨架中，确保 Cas9 基因能够在细胞中正确表达，就像把一个重要的零件安装到机器里。

• 设计并合成 gRNA 序列：根据目标基因的要求，设计特定的 gRNA 序列。然后通过化学合成的方法合成 gRNA 的 DNA 模板，就像设计机器新部件的图纸。

• 克隆 gRNA 基因：把 gRNA 的 DNA 也克隆到质粒中，并让它位于合适的启动子下游。这样，进入细胞后它就能转录出 gRNA 了，就像把部件按照图纸设计来制造。

• 验证载体构建：对构建好的质粒载体进行测序验证，确保 Cas9 基因和 gRNA 基因的序列正确无误，并且载体的各个元件都能够正常工作，就像检验样机各个部分是否都能正常工作一样。

（二）细胞转染

把构建好的 CRISPR - Cas9 载体导入细胞的过程就叫做转染 （transfection，简单来说，就是把外源基因或核酸（DNA 或 RNA）导入细胞中，让它们在细胞内表达或发挥作用）。

常见的转染方法有化学转染、电穿孔转染、病毒感染等。

• 化学转染：化学转染是利用一些化学试剂，像脂质体、聚乙烯亚胺（PEI）等，把载体包裹起来形成复合物，然后通过细胞的内吞作用把复合物摄入细胞内。脂质体转染是一种常用的化学转染方法，它利用脂质体和细胞膜的相似性，把载体有效地导入细胞中。化学转染方法操作比较简单，成本也比较低，但是转染效率会因细胞类型不同而不一样，对于一些难转染的细胞效果就不太理想，就像用一种方法开锁，有些锁能打开，有些就不行。

• 电穿孔转染：电穿孔转染是利用高压电产生电脉冲，在细胞膜上瞬间形成小孔，让载体能够通过这些小孔进入细胞内。电穿孔转染的效率相对比较高，适用于多种细胞类型。不过，电穿孔过程可能会对细胞造成一定的伤害，就像用电钻打孔可能会弄坏周围的东西一样，所以需要调整优化电穿孔参数，以减少细胞死亡。

• 病毒感染：就像前面说的，利用病毒载体把 CRISPR - Cas9 系统导入细胞的过程就叫做病毒感染。病毒感染的转染效率高，能够有效地把载体导入细胞中。但是，病毒载体的制备和使用，必须要有非常严格的生物安全防护措施，防止病毒泄漏对人员和环境造成危害，就像运输危险物品需要特别小心一样。

（三）基因编辑效果评估

在细胞转染了 CRISPR - Cas9 载体之后，需要对基因编辑的效果进行核验和评估。常用的核验和评估方法有下面几种：

• PCR - 测序法：首先，设计针对目标基因编辑位点的特异性引物，通过 PCR 扩增（就是对特定的 DNA 片段，以聚合酶链式反应的方式进行指数式的扩增）已包含编辑位点的 DNA 片段。然后，对扩增产物进行测序，和原生型基因序列进行比对，确定基因编辑的类型（像碱基插入、缺失或替换）以及编辑的效率。这种方法能够准确地检测基因编辑的结果，但是操作相对比较繁琐，需要进行 PCR 扩增和测序等实验步骤，就像做一道很复杂的数学题。

• T7E1 酶切法：T7E1 酶是一种能够识别并切割 DNA 双链错配区域的核酸内切酶。如果基因编辑导致了 DNA 序列的改变，那么在编辑位点处可能会形成双链错配结构。对 PCR 扩增得到的包含编辑位点的 DNA 片段进行变性和复性处理，让错配结构形成。然后用 T7E1 酶进行酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测。检测酶切条带的大小和亮度，可以估算基因编辑的效率。 这种酶切法操作相对比较简单、快速，但是只能半定量地评估基因编辑效率，而且对于一些较小的碱基插入或缺失可能检测不灵敏，就像用一个不太精确的尺子量东西一样。

• 荧光报告基因法：在构建 CRISPR - Cas9 载体的时候，可以同时加上一个荧光报告基因，像绿色荧光蛋白（GFP）基因。当基因编辑成功发生时，荧光报告基因会表达。通过检测细胞内荧光信号的强度，就可以直观地评估基因编辑的效率。这种方法简单直观，但是需要构建带有荧光报告基因的载体，并且可能会受到载体整合位置等因素的影响，就像灯光亮度会受到周围环境影响一样。

（四）动物模型构建

1. 构建小鼠模型：小鼠是常用的模式动物，咱们来看看构建 CRISPR - Cas9 基因编辑小鼠模型的一般流程：

• 设计 gRNA：根据目标基因的序列，设计特异性的 gRNA，并构建相应的 CRISPR - Cas9 载体，就像为小鼠定制一个特殊的工具。

• 制备受精卵：通过超数排卵和交配等方法，获取小鼠受精卵，就像准备一颗种子。

• 显微注射：把构建好的 CRISPR - Cas9 载体通过显微注射的方法注入受精卵的细胞核中。显微注射需要在显微镜下使用精细的注射针把载体准确地注入受精卵中，对操作人员的技术要求极高，就像在一根头发丝上做雕刻一样。

• 胚胎移植：把注射后的受精卵移植到代孕母鼠的输卵管中。代孕母鼠需要经过特殊的处理，让它处于适合胚胎着床和发育的生理状态，就像为种子找一个合适的土壤。

• 子代鉴定：等代孕母鼠分娩后，对子代小鼠进行基因编辑效果的鉴定。通常采用 PCR - 测序方法，检测子代小鼠的基因组中是否发生了预期的基因编辑，就像检查种出来的植物是不是我们想要的样子。

2. 其他动物模型的应用：除了小鼠模型之外，CRISPR - Cas9 技术还被广泛应用于构建其他动物模型，像大鼠、猪、猴等。不同的动物模型都有各自的特点和优势，适用于不同的研究领域。比如说，猪的生理结构和代谢特点和人类比较相似，所以猪模型在医学研究中很有应用价值，可以用来研究人类疾病的发病机制和治疗方法。猴在神经科学、免疫学等领域有独特的优势，因为猴子和人类在进化上比较接近，它们神经系统和免疫系统的功能和人类很相似。构建这些动物模型的基本原理和小鼠模型差不多，但是在具体操作过程中需要根据不同动物的生殖生理特点进行相应的调整，就像用不同的方法照顾不同的宠物一样。

接：DNA上动“手术”——神奇的CRISPR - Cas9 技术（中）