（下）Dynamic stem cell states: nai
图 2 |信号通路及其对naive和primed的多能状态的影响。不同的信号通路可以正向或负向调节naive和primed的小鼠多能干细胞。请注意，显示的大多数信号通路对小鼠的naive和primed的多能状态具有相反的影响（例如，白血病抑制因子 (LIF) - 信号转导和转录激活因子 3 (STAT3) 和成纤维细胞生长因子 2 (FGF2 )–ERK 信号通路)。重要的是要强调，该计划中未包括的其他途径也可能参与此类监管，并且将来可能会进一步表征。这些途径可能包括 HIPPO、RHO、NOTCH 和核因子-κB 信号传导。粉红色方框突出显示在调节小鼠和人类多能细胞中可能发挥不同作用的信号通路。更具体地说，低剂量的转化生长因子-β (TGFβ)、激活素-NODAL、核 β-连环蛋白或 FGF2（不依赖 MEK-ERK）诱导的信号传导是否以不同的方式影响人类naive多能性仍有待充分了解以前在啮齿动物naive胚胎干细胞中观察到的。虚线箭头表示仍有待建立的潜在链接。 BMP，骨形态发生蛋白； ESRRβ，雌激素相关受体-β； GSK3β，糖原合酶激酶 3β； JNK，君样激酶； NuRD，核小体重塑和脱乙酰酶； OCT4，八聚体结合蛋白 4； PKC，蛋白激酶 C； TCF3，转录因子 3。改编自海报 http://www.nature.com/nrm/posters/pluripotency/index.html，自然出版集团。
图 3 |小鼠和人类分离的多能干细胞 (PSC) 中的naive多能细胞特性。左侧第一列列出了可用于区分在 2i/白血病抑制因子 (LIF) 条件下扩增的小鼠胚胎干细胞（naive多能细胞）和在成纤维细胞生长因子 2 (FGF2) 中扩增的小鼠上胚层干细胞的特性/激活素 A 条件（primed的多能细胞）。这两个参考状态用于注释已用于小鼠或人类多能干细胞的各种其他生长条件。对于每种生长条件，我们指出在该条件下培养的细胞是否具有类似naive的特性（以橙色显示）或类似primed的特性（以蓝色显示）。空框表示缺乏特征。这份属性列表可能会随着时间的推移而增加，并可用于系统地注释在独特条件下和从其他物种中分离出来的新多能状态；对于包含来自小鼠、大鼠、人类和恒河猴的多能细胞的扩展表，请参见补充信息 S1（图）。
BMPi，骨形态发生蛋白抑制剂； DNMT1，DNA甲基转移酶1； FBS，胎牛血清； H3K27me3，组蛋白 H3 Lys27 三甲基化； ICM，内细胞团； JNKi，Jun样激酶抑制剂； KLF，Krüppel 样因子； MBD3，甲基 CpG 结合结构域蛋白 3； MEF，小鼠胚胎成纤维细胞； METTL3，甲基转移酶样蛋白 3； OCT4，八聚体结合蛋白 4； OxPhos，氧化磷酸化； PGCLC，原始生殖细胞样细胞； PKCi，蛋白激酶 C 抑制剂； PRDM14，PR 结构域锌指蛋白 14； ROCKi，RHO 相关蛋白激酶 1 抑制剂； TFE3，转录因子 E3； TGFβ，转化生长因子-β； TSC，滋养层干细胞。
*无雌激素相关受体-β (ESRRβ)。 ‡小鼠宿主胚胎。改编自海报http://www.nature.com/nrm/posters/pluripotency/index.html，自然出版集团。
图 4 |表观遗传抑制因子对小鼠naive和primed多能细胞的相反影响。小鼠naive和primed多能细胞的不同不仅在于它们对不同信号通路的依赖和它们的表观遗传特征，而且还在于它们的谱系决策。在 2i/白血病抑制因子 (LIF) 或胎牛血清 (FBS)/LIF 条件下扩增的小鼠naive胚胎干细胞 (ES 细胞) 可耐受 DNA 甲基转移酶 1 (DNMT1)、甲基 CpG 结合域3 蛋白(MBD3)、DICER、DGCR8、甲基转移酶样蛋白 3 (METTL3)、EED 和 EZH2等表观遗传抑制因子的完全丧失蛋。此外，表观遗传抑制因子的丧失加强了有利于多能性促进因子的平衡，并产生了“超naive”多能细胞，这些细胞对分化具有相对更强的抵抗力，并且可以耐受 LIF 细胞因子的撤出。鼠primed的上胚层干细胞 (EpiSCs) 通常以相反的方式对表观遗传抑制因子的完全消融作出反应。与naive多能细胞相比，已建立的小鼠primed的 EpiSC 自然下调多能因子并上调谱系因子。在primed多能性阶段的表观遗传抑制因子的消融提示平衡分化和/或损害细胞存活。应该注意的是，各种表观遗传抑制因子（如 METTL3 或 DGCR8）的消融总体上会对primed的多能性的稳定性产生负面影响；然而，导致状态崩溃的下游事件不一定在每种情况下都相同，因此应该在体外和体内彻底剖析。
FGF2，成纤维细胞生长因子 2。经 REF66许可改编 AAAS.。
人类常规多能细胞
从囊胚中分离出的第一批人类 ES 细胞在特征和组织培养要求方面与鼠 ES 细胞明显不同。 FGF2 和转化生长因子-β1 (TGFβ1)/激活素 A 信号传导（但不是 LIF 信号传导）是维持此类源自 ICM 的常规人类 ES 细胞或通过直接体外重编程获得的 iPSC 的核心信号传导模块。
primed的多能状态。传统常规人类和小鼠 ES 细胞之间的差异最初被归因于物种之间未知的遗传差异，因为人类 ES 细胞也来自 ICM，而不是来自植入后阶段。然而，对来自不同小鼠品系的干细胞的研究已经发现，如果未设计naive条件来匹配所用供体胚胎的特定遗传背景的要求，ICM 细胞可以在体外适应primed状态。具体而言，与 129 小鼠相比，NOD 小鼠对产生naive ES 细胞和 iPSC 的“宽容度”相对较低，因为仅 LIF 不足以维持 NOD 小鼠细胞的naive多能性，并且永久需要 2i/LIF 条件来稳定和维持naiveNOD PSCs30 的体外多能性。此外，来自 129 和 NOD 小鼠的 ICM 细胞在primed条件下扩增产生 EpiSC 样细胞，这些细胞与来自 E6.5 胚胎的 EpiSC 或在体外来自已建立的 ES 细胞 30 无法区分。
人类常规 ES 细胞和 iPSC 保留大量primed的多能性特征这一事实支持了后一种体外primed方案与确定常规人类 ES 细胞身份的相关性。这些包括naive多能性标志物（如 KLF17 和发育多能性相关蛋白 3（DPPA3））的低水平表达，H3K27me3 沉积在发育基因上，缺乏转录因子 E3（TFE3）的专一核定位，抑制 MEK-ERK 信号传导后的多能性，缺乏在 ICM 细胞中的整体低甲基化现象，在大多数常规雌性 PSC 细胞系中缺乏前 X 失活状态70,89,90。此外，人类primed的 ES 细胞不能耐受 DNMT1 的完全丧失（参考文献 86），类似于小鼠 EpiSCs66（图 4）所显示的。迄今为止，人类 ES 细胞尚未实现 DICER、MBD3 或 METTL3 的完全敲除64、66（图 3）。
比鼠 EpiSC 的更少的primed状态。尽管如此，重要的是要认识到人类常规或已primed的 ES 细胞与鼠 EpiSC 不同，并且可以被认为是相对较少primed的。例如，人 ES 细胞不会上调 FGF5 或 N-钙粘蛋白的表达（如在鼠 EpiSC 中所见），而人 ES 细胞表达高水平的 E-钙粘蛋白（如在小鼠naive ES 细胞中检测到的）70。人类 ES 细胞表达高水平的一些naive多能性标志物，例如 NANOG、PRDM14 和表达减少的蛋白 1（REX1；也称为 ZFP42），这些标志物不被小鼠 EpiSCs91 表达或残留表达。此外，人primed的 ES 细胞在功能上依赖于 NANOG 和 PRDM14，并且这些因子的消融诱导人 ES 细胞的分化 91。人 ES 细胞中 DNA 甲基化的分布对应于在 FBS/LIF 条件下扩增的小鼠naiveES 细胞，而不是 FGF2/激活素 A 扩增的小鼠 EpiSCs，因为人 ES 细胞和小鼠naive ES 细胞的primed子是通过抑制性 DNA 甲基化保护免受入侵84,92。此外，虽然鼠 EpiSCs 表现出 TFE3 的专一性细胞质定位，而naive 2i/LIF 培养的 ES 细胞显示出 TFE3 的专一性核定位（参考文献 93），但人类primed的 ES 细胞显示出一种中间构型，其中 TFE3 存在于细胞质和细胞核中70。
人类naive多能细胞
naive和primed多能状态的亚稳定性取决于所使用的生长条件30，以及对外源因素的严格要求，以促进从以前“非允许”啮齿动物菌株中分离的naive PSC 的naive多能性 30,31，导致考虑是否可以使用独特和更严格的条件来隔离人类以前未识别的替代天真的多能状态。
转基因依赖。 2i/LIF 条件不足以维持naive的人类 ES 细胞或iPSCs94。然而，额外的转基因表达可以诱导可能具有相当大的兴趣的人工转基因依赖状态。持续的外源 OCT4 和 KLF4，或 KLF2 和 KLF4，转基因表达可以在 2i/LIF 条件下将人类 ES 细胞和 iPSC 维持在独特的多能状态94。最近，通过优化 KLF2 和 NANOG 转基因的过表达来扩展这些观察结果，允许在 2i/LIF 条件下扩增人类naive iPSCs95。 KLF2 和 NANOG 转基因在primed ES 细胞中的过表达也使它们能够在 2i/LIF/aPKCi 条件下扩增96。这些细胞具有广泛的 DNA 低甲基化和naive多能性标志物的显着上调，例如转录因子 CP2 样蛋白 1 (TFCP2L1)、KLF2 和 KLF4。然而，由于 KLF2 在人类 ICM97 中不表达，且2i/LIF/aPKCi 条件不足以在没有外源转基因诱导的情况下转化primed的 ES 细胞 96，并且由于无转基因细胞在 2i/LIF/aPKCi 条件下仍有待验证，因此它是不清楚在不保留可能泄漏的转基因或 MEF 的情况下，这种状态是否无限期稳定。此外，对这些细胞中 DNA 甲基化景观的独立检查表明，内源性逆转录病毒基因存在异常的全局印记丢失和过度低甲基化 89,98。最后，虽然 2i/LIF/aPKCi 条件不包含外源性 FGF 或 TGFβ1/激活素 A 细胞因子，但 FGF 受体 (FGFR) 和 TGF 受体 (TGFR) 信号传导的短期抑制不足以证明细胞的独立于FGF、TGF 和激活素 A 信号转导 96（图 2）。事实上，与小鼠不同，人类多能 ICM 在用 TGF 和激活素-NODAL 信号传导的小分子抑制剂处理囊胚后会发生分化。
尽管该领域已转向研究转基因非依赖性条件，如下详述，但应注意转基因依赖性状态可能仍然很重要，因为目前在小鼠 ES 细胞中获得的强大的naive多能性可能是啮齿动物特异性的现象。捕获与从小鼠获得的相同的人类naive PSC 可能仍涉及基因改造。然而，以下研究提供的证据表明，在人类和其他物种中产生替代多能状态是可能的 30,94。
不依赖转基因。我们的团队是第一个描述naive多能性生长条件 - 指定为 NHSM（naive人类干细胞培养基） - 这涉及完全消融 MEK–ERK 信号，并且与基因未修饰的人类 PSC 的无限扩张兼容，在两种含有 MEF 的和无 MEF 条件下70。这些naive的不依赖 MEK 的多能细胞系可以来自人类植入前胚胎，通过从头 iPSC 生成，或来自先前建立的primed ES 细胞和 iPSCs70。 NHSM 条件包含 2i/LIF 以及 p38 抑制剂 (p38i)、Jun N 末端激酶抑制剂 (JNKi)、aPKCi、RHO 相关蛋白激酶 1 抑制剂 (ROCKi) 以及低剂量的 FGF2 和 TGFβ1（或 Activin A）；它们使人类 PSCs 与鼠naive PSCs70 更相似但不相同（图 2，3）。事实上，在 NHSM 中培养的人类细胞具有所谓的naive 2i/LIF 诱导的基态多能性特征，即使在 FBS/LIF 条件下扩增的naive小鼠 ES 细胞中也没有发现这种特征。这些特征包括 TFE3 的独家核定位和 H3K27me3 标记在发育基因上的去甲基化 69,70,93。在转录方面，这些细胞下调了 OTX2、ZIC2 和 CD24 等谱系定型标志物的表达，并适度上调了多能性基因的表达（在 MEF 上培养和使用 aPKCi 时更为显着）70,99。在这些人类naive PSC 中已经实现了增强子重新布线，如在小鼠细胞中所见 71。这些细胞的 DNMT3B100 表达下调，DNA 甲基化水平整体小幅下降，同时保持印记完整性和染色体稳定性 70。尽管人类 PSC 的嵌合分析和使用人类胚胎作为宿主在伦理和法律上是被禁止的，但这些人类naive PSC 首次显示，在显微注射到宿主小鼠桑葚胚中后，真正整合到囊胚中，并且能够在经历了晚期器官发生的 E10.5-E17.5 的小鼠胚胎的做出低级贡献。 70（图 3）。
此后出现了描述产生不依赖人类 MEK 的naive多能细胞的替代条件的重要文章，每一篇都描述了具有不同增强分子特性的细胞的产生（图 3）。 2i/LIF、ROCKi、BMP 受体抑制剂 (BMPRi) 和高剂量 FGF2 和 TGFβ1 的组合只能在 MEFs101 存在的情况下维持人类 PSC。这些 PSC 具有多能性标记如 STELLA（也称为 DPPA3）和 KLF5 的转录上调。另一项研究描述了使用在 NHSM70 中发现的大多数相同成分（2i/LIF、ROCKi 和 Activin A（而不是 TGFβ1）——有或没有 FGF2 和 JNKi）但添加了 Ser/Thr 蛋白激酶 BRAF和 SRC 途径抑制剂的培养条件 95（称为 5i/LA-MEF 条件）。与以前的研究相比，5i/LA-MEF 条件下的细胞对naive多能性标志物的上调更为显着。然而，这些细胞没有下调 DNMT3B 的表达，在雌性细胞系中保持非活性 X 染色体状态，并且具有不寻常的前 ICM 转录特征95。有趣的是，在 5i/LA-MEF 条件下将primed的细胞转换回naive状态的过程效率低下，需要 2 周时间才能分离出保持缓慢生长速率的初始克隆 95。此外，这种条件下仅产生染色体异常细胞系95。因此，仍有待确定此类染色体异常是否实际上是 5i/LA-MEF 扩增细胞所固有的，并确定针对此状态描述的特性 95，以及是否在这种低效的转换过程中选择它们。最后，这些细胞的 DNA 甲基化分析和表观遗传印记完整性是有待评估的重要方面。
从上述总结中可以清楚地看出，许多已发表的条件都不会产生与小鼠 ES 细胞或人类 ICM97、102、103 相同的人类naive PSC。然而，这些研究表明新的信号通路与人类naive多能性有关，并提出了进一步优化和表征此类新型 PSC 的研究途径（图 2）。从机制上讲，通过将 GSK3i/IWR1 条件 73 应用于人类naive PSC 来测试 RAF 和 aPKC 抑制之间是否存在联系以及调节 WNT 信号传导的影响将会很有趣。此外，已显示 RHO 信号传导可促进 YAP 和 TAZ 在primed的人类 ES 细胞中的核定位并维持它们的多能性 104。因此，ROCKi 是否通过 YAP 和 TAZ 的调制影响naive多能性特征仍有待确定。
MEK 非依赖性 FGF2 和 TGFβ1/激活素 A 信号传导的作用，无论是以自分泌方式还是以低剂量外源提供，在人类naive PSC 中仍有待理解。这些细胞表现出激活素样配体生长分化因子 3 (GDF3)96 的上调，而人（但不是小鼠）ICM 细胞大量表达激活素受体 97。因此，很容易推测，由于它们对激活素样配体的反应存在差异，已primed的人类 ES 细胞比鼠 EpiSCs 的primed相对较少，这可能会促进人类细胞中的一些naive特征70,95，但不会促进小鼠细胞中的某些naive特征。总之，系统分析来自不同物种的不同状态的多能细胞对各种TGF-配体家族成员的反应是重要的（图2）。不能排除产生完全独立于 FGF 和/或 TGF 信号传导的人类 PSC 的可能性。
小鼠和人类上胚层之间的差异
最近关注人类植入前胚胎单细胞 RNA-seq 的研究开始为上面强调的一些问题提供答案。尽管人和小鼠胚泡之间没有形态学差异，但它们在细胞水平上具有显着的分子差异 97（图 5a、b）。人类 ICM 上胚层细胞不表达 KLF2 和 ESRRB 等被认为是小鼠重要多能性因子的基因。相反，KLF17 可能在 ICM97 中具有人类特有的作用。GTPase ERAS，它是一种 ES 细胞特异性形式的RAS，已成为人类的假基因 105，而 ERAS 缺失的小鼠 ES 细胞在 FBS/LIF 条件下增殖缓慢 105。非人类灵长类动物（狨猴）多能上胚层具有与人类上胚层相似的转录特征，这与小鼠上胚层非常不同。狨猴和人类naive ICM 特征包括缺乏 KLF2、核受体亚家族 0 组 B 成员 1 (NR0B1) 和 BMP4 的转录，具有NODAL 及其下游信号介质的高水平表达106。
在植入后阶段，啮齿动物和人类胚胎之间存在重大差异（图 5a、b）。啮齿动物的不寻常之处在于它们的植入后上胚层呈卵状圆柱体形状，而在人类中，植入后的上胚层呈扁平圆盘状，类似于大多数其他哺乳动物。虽然不可能对早期人类植入后上胚层进行单细胞分析，但对非人类灵长类动物的研究可能会提供一些相关的见解。总的来说，物种之间的这些差异可能直接影响在体外不同物种的 PSC 中观察到的不同多能特性及其不同的生长要求。此外，它们与了解体外分离的人类多能细胞的发育背景有关。
图 5 |将“相对naive”分类在naive到primed多能性的范围内的模型| a. 小鼠和人类的早期植入前和植入后体内发育存在重要的相似之处和差异。尽管小鼠和人类胚胎在胚泡阶段之前在形态上是相似的，但存在重要的转录差异如 b 部分所述。此外，在植入后阶段，小鼠和人类之间胚胎形状的形态差异变得明显，包括上胚层形状和胚胎外结构的差异。在小鼠中，naive胚胎干细胞 (ES 细胞) 可以来自植入前囊胚的内细胞团 (ICM) 或在应用naive生长条件时来自植入后上胚层。上胚层干细胞 (EpiSCs) 可以来自植入后上胚层或在使用primed培养条件时来自 ICM。因此，生长条件而不是细胞来源决定了体外获得的多能状态配置。根据所使用的生长条件，类似的情况适用于从人 ICM 中衍生naive和primed的多能细胞。由于伦理问题，多能细胞不能来自人类植入后的胚胎；因此，缺乏对这些细胞的分子分析。c |一个模型来解释从naive到primed多能性的范围内的“相对naive”。在我们看来，可用于分离naive多能细胞和primed多能细胞的一个主要分子和功能标准是它们在阻断 MEK 活性后维持和稳定其多能状态的能力（黑色虚线）。在naive多能状态下，很难用绝对术语来描述细胞的多能状态，因为naive细胞在某种程度上也可以具有primed多能性的特征。类似地，在primed的多能性范围内，在不同条件下培养的primed的多能细胞具有不同的特征和不同程度的naive（图3）。最后，用非典型蛋白激酶 C 抑制剂 (aPKCi)、成纤维细胞生长因子受体抑制剂 (FGFRi) 或 NOTCH 抑制剂 (NOTCHi) 等小分子补充 2i/白血病抑制因子 (LIF) 条件是可能的naive多能性特征，特别是对于其他啮齿动物如大鼠，naive细胞在 2i/LIF 无饲养层条件下的稳定性应进一步提高。对不同人类多能状态的完整注释将有助于绘制人类和其他灵长类多能干细胞的等效图谱。 DNMT3L，DNA 甲基转移酶 3 样； ERAS，ES细胞表达的RAS； ESRRB，雌激素相关受体-β； FBS，胎牛血清； GSK3i，糖原合酶激酶 3 抑制剂； KLF，Krüppel 样因子； TGFRi，转化生长因子受体抑制剂； XIST，X 非活动特异性转录本。 a 和 b 部分改编自 Nature Publishing Group 的海报http://www.nature.com/nrm/posters/pluripotency/index.html。 c 部分经 REF4 许可改编, 爱思唯尔。
多能状态的分类
分离具有不同特征的人类naive PSC 的不同条件的表征，以及在人类中进行嵌合分析的局限性，激发了关于多能状态分类的讨论。人们经常声称，在新设计的生长条件下从人类 ICM 细胞中获得 ES 细胞的能力构成了证明naive的“黄金标准”。然而，应该记住，多能状态身份最终取决于衍生生长条件，而不是细胞来源是植入前还是植入后上胚层30、33 或 PGCs82。使用 OCT4 远端与近端增强子元素作为二元区分标记也可能被误解 95。在人类和小鼠中，OCT4 的远端和近端增强子元件在naive和primed的多能状态下都是活跃的 107,108。差异来自它们的相对活动水平（高与低）和主导地位。
依靠单一属性标记或功能测试来定义多能状态是有局限性的，并且必须伴随对不断增加的特征数量的系统分析，这些特征不断被识别为不同的多能状态（图 3，4）。然而，在我们看来，一个分子和功能特征可以被认为是naive和primed多能状态之间的主要划分，是细胞对阻断 MEK 信号传导的挑战的反应（图 5c）。人类常规 ES 细胞和小鼠 EpiSC 在 MEK 抑制后迅速分化，而naive多能细胞耐受 MEK 抑制并在这一挑战后巩固其naive性94。 MEK 或 ERK 抑制在 ICM 中扩大小鼠上胚层的能力以及它表明体内naive多能性的巩固这一事实支持了这一特征的重要性。
在多能性的naive和primed态中，很明显，如果考虑最初针对小鼠naive 2i/LIF 培养的 ES 细胞和primed的 FGF2/激活素 A 培养的 EpiSCs 描述的许多naive和primed的多能性特征，则不同的多能性生长条件可以同时赋予同一细胞类型中的初始和naive特性的混合物（图3）。因此，多能状态可以通过具有更多此类属性而被归类为“更naive”或“更primed”（图 5c）。人类primed ES 细胞具有naive多能性的几个特征（例如保护primed子区域免受高甲基化和对 NANOG 的依赖），最近与人类胚泡单细胞 RNA-seq 的比较分析表明，一些常规人类 ES 细胞系在转录组方面比之前想象的相对更少的primed态97。在 FBS/LIF 条件下扩增的小鼠naive ES 细胞可以产生“全 ES 细胞”嵌合胚胎并耐受 Dnmt1 和 Mettl3 的消融；然而，如在 EpiSCs 中所见，它们在整体上被高度甲基化并获得发育基因上的 H3K27me3 标记（图 3,5c）。因此，与 2i/LIF 条件相比，FBS/LIF 条件似乎赋予小鼠 ES 细胞相对不那么naive的特性。
另一项可用于评估不同灵长类naive PSC 的严格性和naive程度的功能测试是细胞是否能耐受表观遗传抑制因子如 METTL3、DNMT1、DGCR8 和 MBD3 的完全消融（参考文献 4,66）（图 3， 4）。此外，此类测试可能有助于优化可缩小小鼠和人类naive多能细胞之间差距的条件（框 1；图 4）。根据这些标准，从迄今为止已分离的其他物种中注释不同的naive和primed状态也将是有益的（图 3）。
BOX 1 |naive的多能性的“黑暗面”？随着naive多能性培养条件的发展以及赋予细胞更多naive特征的努力，询问需要多少naive以及永久维持多能干细胞（PSC）是否存在“黑暗面”在某些naive的条件变得相关。
在 2i/白血病抑制因子 (LIF) 条件下扩增的啮齿动物胚胎干细胞 (ES 细胞) 获得基因组异常的趋势增加 41，目前尚不清楚这些改变是否是使用小分子抑制剂95,116 或作为naive多能性的内在分子特征的直接结果（例如，内源性逆转录病毒元件的活性增加或表观遗传抑制标记的减少）。人们可以设想这样一种情况，在这种情况下，这种特征可以在体内被容忍，因为这种配置只存在 1-2 天，而这种状态的长时间体外扩张可能会增加不需要的破坏性事件的频率。
这种担忧也可能与保护 DNA 甲基化的完整性和印记在体外扩展的naive PSC 中的完整性有关。专注于将小鼠 PSC 转移到 2i/LIF 条件下 DNA 甲基化丧失的研究已经量化了转移后 10-24 天的甲基化水平，并记录了 DNA 甲基化的快速全局丧失，伴随着反转录转座子和印记区域的相对抗性这种去甲基化83。
然而，尚不清楚这种甲基化状态是否代表naive细胞达到的最终平台，或者在 2i/LIF 条件下进一步培养是否会导致这些区域对去甲基化的相对抗性降低。事实上，在 2i/LIF 条件下，印迹基因和反转录转座子的甲基化发生了部分但却显著地降低。
如果这种影响经常发生，研究人员将不得不重新评估如何优化naive条件的应用。一种情况可能涉及降低抑制剂水平以避免过度低甲基化或其他不良影响。另一种方案是将细胞维持在primed的多能性培养条件下，并在分化开始前将它们转移到naive培养条件下的短时间内。
影响和未来方向
体细胞有可能被重编程为多能性这一突破性发现为多能性状态更深入的研究和理解多能配置可以重新布线奠定了基础。重编程细胞以实现多能性的能力直接影响到与人类IPSCs的质量和特性相关的当前障碍和限制(BOX1，2)。
与从naive到primed的多能性连续体相关的最有趣的问题之一是为什么存在这些不同的多能性配置。这通常伴随着务实的考虑，即哪些细胞——naive的或primed的——更适合使用。在我们看来，由于这种现象深深植根于体内早期胚胎发育，因此naive和primed配置都可能构成发育过程中必不可少的组成部分，以同时优化和最大化多能性和谱系规范的好处。我们假设naive多能性作为一种表观遗传擦除状态出现，它使多能细胞不受谱系和表观遗传限制，同时使这些细胞对可能干扰这种谱系中性状态建立的信号通路的反应相对较低。在建立naive多能性期间或之后，在没有短暂的“延迟期”的情况下，形态发生素对分化的诱导可能无法有效实施。因此，在植入后阶段，naive的多能性网络逐渐被解决并变得更容易接受感应线索，并且在明显的体细胞分化发生之前，PSC 根据它们的空间定位进行不同的图案化和启动。
在功能水平上，使用人类naive的PSCs作为起始材料，无论是否有短暂的primed阶段，是否会解决目前与人PSCs体外分化方案相关的问题仍有待确定。人类naive的PSC会在独立的IPSC系110之间增加分化的一致性吗？当用作起始材料时，单纯的PSC条件能在分化方案中产生更高质量的细胞吗？人类naive的PSCs可以用于人类常规PSCs不成功的分化方案吗？最近的结果为这种可能性提供了令人鼓舞的支持，该结果显示在NHSM条件下(即使在没有aPKCi的情况下)扩增的人PSCs经历体外分化为PGC的能力增强，这是一项曾经对于primed的人类PSCs 111来说效率不高的分化方案。评估以上强调的潜在益处的分子基础是，与primed的多能性70，96相比，naive的多能性更多地与去除调节区的表观遗传抑制标记有关。这可能会在naive多能细胞分化过程中更有效地激活谱系说明子。此外，人类primed的PSCs中的谱系偏见与抑制标记的局部积累密切相关，例如DNA甲基化112。
在产生人类naive的PSCs方面的最新进展将继续推动从其他物种产生naive的PSCs的尝试，并测试相同物种和不同物种的胚胎嵌合体分析113。在NHSM条件下获得的食蟹猴naive ES细胞产生了第一个来自非人类灵长类动物的嵌合体活性ES细胞114。在注射naive的人70或猴子IPSCs115后，获得了发育成熟的小鼠胚胎(E10.5-E17.5)，并获得了低水平的嵌合体。这些观察提出了与定义这种整合的灵长类IPSC来源的细胞的频率、线龄偏好和发育质量相关的各种问题。系统的努力将是确定人性化动物模型70是否可能与疾病建模、人类发育研究或可移植人类组织的产生有关的关键113。
单细胞技术的持续突破及其在不同多能细胞类型和胚胎样本中的应用将有助于识别与PSCs充分功能相关的特性。这将有助于为以干细胞为基础的治疗和研究设定最佳起始材料的标准(BOX1)。预计，尽管人们正在调查这种之前被低估的多能性复杂性，以使科学家能够更好地控制细胞命运，但拟议的准则和标准将需要辩论和修订。
BOX 2 | 诱导多能干细胞 (iPSC) 重编程的潜在影响
最近的研究阐明了某些表观遗传调节因子如何对维持naive和primed的小鼠 PSC66 产生相反的影响（图 4）。在比较人类与小鼠中多能性机制的诱导时，这些发现可能是相关的，因为人类 iPSCs 而不是小鼠 iPSCs，通常在常规（primed）多能性条件下重新编程 117。因此，在人和小鼠 iPSC 调节剂之间观察到的一些差异可能与物种差异无关，而是与诱导不同的多能状态有关。因此，必须扩展人类 iPSC 重编程调节器的筛选，以包括不同的多能性条件，因为这些条件可能会产生不同的结果。
与多能状态特征对重编程的影响有关的另一个考虑因素是naive条件是否可能提高获得的 iPSC 的质量并促进残留表观遗传记忆和异质性的丧失118,119。类似地，核移植胚胎干细胞和由相同人类供体细胞产生的 iPSC 之间 DNA 甲基化的细微表观遗传差异也可能在更接近模拟内细胞团的表观遗传特征的naive条件下获得 iPSC 时被中和。
