高通量、高灵敏度的scRNA-seq方法揭示克隆型酵母的转录相关
文献下载链接： Sensitive high-throughput single-cell RNA-Seq reveals within clonal transcript-correlations in yeast populations
发表期刊：《Nature Microbiology》
影响因子：17.745
时间：2019年
1. 实验原理
单细胞分离载体：96孔板
建库测序方法：5'端测序
实验原理图
2. 实验方法
2.1 实验材料
酵母株系：野生型酿酒酵母-BY4741；单倍体酿酒酵母-YJM789
培养基：YPD培养基
细胞大小：通过FACS的FSC测量
YJM789是一种较不常用的单倍体酿酒酵母菌株。在基因组水平上，YJM789与参考菌株分别有大约60,000个单核苷酸多态性(SNPs)和6,000个indels的差异，这里用来计算双胞率（验证小于1%）
2.2 数据分析质控
UMI质控：测序重复次数>3
细胞质控：uniquely-mapped reads>500k ; expressed genes>1000
2.3 细胞分析
用于分析的细胞数：
- BY4741： clean_data: 127 cells （raw_data:190 cells）
- YJM789： clean_data: 48 cells （raw_data:95 cells）
3. 结果分析
3.1 方法学对比分析
与2017年一篇文献使用C1的SMART-seq数据结果对比：作者认为自己的方法获得的gene/per cell更高(3399 versus 2392），同时具有良好的全基因组相关性。
与SMART-seq对比
3.2 细胞体积与表达量关系
细胞体积越大，mRNA表达量越高
细胞大小和细胞转录表达丰度相关性：x轴延伸表示细胞转录表达增加；y轴延伸表示细胞大小(FSC-value)增加
3.3 聚类和通路分析
两种酵母可以明显分群：tSNE分析揭示了两个不同的菌株特异性簇
tSNE plot 由两种已知菌株的单细胞转录组数据获得 (n=127 BY4741 and n=48 YJM789)
（1）KEGG富集分析
可变基因在细胞周期相关转录本中富集。同时，最大的可变基因组属于代谢途径，eg: 半乳糖和糖酵解糖/糖异生等
可变基因的检测：x轴延伸表示均一化UMI数目增加；y轴延伸表示归一化UMI计数的平方变异系数增加；可变基因为红色；ERCCs为蓝色；实线绿色表示技术噪声拟合。偏离技术噪声的基因，其生物变异系数高于阈值（CV2>0.25）即被判定为可变基因
可变基因进行KEGG富集分析，并基于效应大小排序
（2）亚群细分
为了了解BY4741群体内的变异性，作者通过tSNE分析鉴定了两个不同的簇。
127个BY4741通过Seurat 使用0.6作为分辨率参数生成该图，一个点代表一个细胞，点的大小代表细胞大小(FSC-value)
（3）亚群注释
BY4741的两个细分cluster，他们的差异基因分别注释到细胞周期调控基因，因此作者对其做了如下阶段性排序：
- Cluster1包含了表达早期(M/G1)和晚期（G2/M）细胞周期基因的细胞
-
Cluster 2则富集了表达G1、S和晚期S/G2基因的细胞
BY4741中cluster1和cluster2的细胞周期阶段可视化，x轴上排列的每个点代表对应cluster特异性基因的表达
（4）互作分析
由于大多数可变基因与糖的代谢过程有关，如糖和核苷酸代谢，我们评估了这种变异与细胞周期无关：
可变半乳糖基因(GAL3、EMI2、GLK1、HXK1)的表达叠加到tSNE上，没有观察到细胞周期分离
每个点代表BY4741中的细胞，颜色比例表示标准化的UMI表达量
使用混合碳源培养基时，细胞会首先消耗葡萄糖，并产生乳酸。当葡萄糖耗竭后，细胞开始消耗半乳糖，同时也消耗乳酸。推测原因可能为：负责半乳糖自胞外向胞内运输的转运蛋白的效率较低，故半乳糖消耗较慢，难以维持细胞活率和能量需求，需要利用胞外的乳酸作为补充碳源。已有研究表明半乳糖诱导的基因在葡萄糖（YPD）存在下受到严格抑制，并已被用作了解转录噪声和调控的模型。
（5）基因相关性分析
有趣的是，对于BY4741，作者在几乎所有的细胞中都检测到了至少一个属于半乳糖途径的可变基因的表达
所有半乳糖可变基因表达，每个bar表示标准化的UMI表达量
（5）半乳糖途径相关基因分析
为了了解半乳糖基因的表达是否协调，分析了所有半乳糖代谢基因的成对表达。没有观察到基因对之间有任何强相关性，这表明在单个细胞中的表达调控不协调。
半乳糖相关基因的成对Pearson相关性，颜色越红表示相关性越强
（6）结论验证
假设，如果细胞面临碳源的快速变化，葡萄糖生长过程中半乳糖基因的异质性可以提供一种选择优势。虽然所有群体在YPD中的生长率都相似，但在YPD中表达Gal3的前2%的细胞在半乳糖中表现出更高的适应性。
Gal3-GFP Top 2% 和 Gal3-GFP Random酵母在YPD培养基和YPGal培养基上的生长曲线
最后感叹：
- 酵母中普遍存在的可变剪切所造成的复杂转录结构，需要在单细胞水平上解决。
- 通过细胞周期调控转录本的分析结果表明：细胞之间的基因表达存在高度的异质性
- 半乳糖代谢相关基因的研究结果表明：随机基因表达在单细胞水平上对细胞适应度具有功能意义。
