Drop-seq实现酿酒酵母&白色念珠菌单细胞测序的方法

文献下载链接：
mDrop-seq: Massively parallel single-cell RNA-seq of Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans
发表期刊：《Vaccines (Basel) 》
影响因子：5.048
时间：2021年
PS：如果不是找实验方法，文章不建议大家看（它会浪费你的时间）

0. 文献汇总

• 检测35,109个酿酒酵母细胞（median_UMI/per_cell:400-600; median_gene/per_cell:300-400），并量化了热休克酿酒酵母与对照酵母的表达差异；
• 检测39,705个白色念珠菌细胞（median_UMI/per_cell:500-700; median_gene/per_cell:300-600），并定量氟康唑处理白色念珠菌与对照念珠菌的表达差异（如细胞周期模式的变化和组蛋白活性的显著增加）

实验材料：

• 酿酒酵母 (菌株BY4741）：裂解时长测试+热休克处理测试
• 白色念珠菌 (菌株SC5314)：裂解时长测试+氟康唑处理测试
• 酿酒酵母+白色念珠菌 (菌株BY4741+菌株SC5314)-->用于多胞率分析

分析内容：

• 不同处理组的相关性分析
• 不同处理组的marker基因分析
• 细胞周期分析
• 拟时序分析

图1. 实验原理和方案设计：（左）边通过drop-seq device生成油包水的液滴并回收，置入水浴锅中孵育；（右）1. 酿酒酵母的裂解测试中，仅对15min和20min实验做后续分析，并分别重复两次（分别标记Rep1,Rep2）；2. 酿酒酵母热休克处理重复两次（分别标记Rep1,Rep2）；3. 混合菌种测试重复两次（分别标记Rep1,Rep2）；4. 白色念珠菌的裂解测试分三组（15min, 20min，25min）5. 白色念珠菌-氟康唑处理组设置1.5h和3h，并分别重复两次（分别标记Rep1,Rep2）

1. 酿酒酵母单细胞转录组测序

1.1 酿酒酵母-Control组

1.1.1 裂解时长优化

酿酒酵母细胞悬液通过drop-seq仪器产生油包水的液滴， 获得的产物被分成三份，分别放入三个37摄氏度的水浴池孵化（孵育时间分别：10min,15min,20 min）。

• 孵育后，用光学显微镜检查液滴，以确保液滴的稳定性和细胞裂解
• 10 min裂解孵育产生较少的cDNA，表明不完全裂解（后续未被分析）

1.1.2 双胞率测试（混合菌种）

菌株BY4741+菌株SC5314等比例混合，设置两种浓度分别测试：700,000 cells/mL，350,000 cells/mL

1.1.3 数据分析

过滤掉 gene<200（质量差） or gene > 2000（多胞）的barcode

(1) 相关性分析

• SC_15min_Rep1与SC_20min_Rep1相关性高达0.99，因此后续将其数据合并

  
  图2.SC_15min_Rep1与SC_20min_Rep1的相关性分析：从图A到图C可以看到SC_15min_Rep1与SC_20min_Rep1在3个不同维度的基因表达都极度重合，因此存在极大的相关性

(2) 高表达gene分析

• 酿酒酵母中高表达基因分别参与了糖酵解(TDH3、ENO2、FBA1)、应激反应(HSC82)或核糖体生物发生(RPP2B)。

  
  图3.酿酒酵母细胞分群和高表达基因汇总：（图B）不同裂解时长的gene/per cell和UMI/per cell小提琴图：横坐标代表不同分组，纵坐标分别代表基因和UMI的定量；（图C）SC_15min_Rep1与SC_20min_Rep1整合数据集的UMAP图；（图D）酿酒酵母高表达基因箱线图：横坐标代表基因在细胞中表达占比，纵坐标代表不同的基因

作者也将自己的scRNA-seq数据与现有RNA-seq数据库做对比，转录本数量相关性约为85%

(3) 多胞率检测

• 物种混合实验验证多胞率：细胞浓度350 cells/ul (left; λ = 0.08)的多胞率 ~2.3%；细胞浓度700cells/ul (right; λ = 0.15)的多胞率 ~4.2%

图4.物种混合实验比对分析图： 横坐标代表比对到C. albicans的UMI数量，纵坐标代表比对到S. cerevisiae 的UMI数量，蓝色的点代表S. cerevisiae，红色的点代表C. albicans，紫色的点代表两者混合

1.2 酿酒酵母-热休克组

1.2.1 方案设计

酿酒酵母细胞置于42摄氏度的环境中20min后，然后置于冰上冷却用于mDrop-seq，其中SC_15min_Rep1与SC_20min_Rep1的整合数据集被作为对照。

1.2.2 数据分析

(1) 相关性分析

• 热休克处理设置了2个生物重复：表现出极高的相关性（相关系数0.96）

• 与对照组相比，热休克处理组中多个应激反应基因显著上调

  
  图5.热休克处理与对照组相关性分析：(图A)热休克处理中2个重复组gene检出和UMI定量的小提琴图；(图B)对照组和热休克处理组的相关性分析：横坐标代表热休克组的标准化基因表达量，纵坐标代表对照组的标准化基因表达量，每一个点代表一个基因

(2) marker基因分析

• 热休克蛋白（HSP）家族基因在Heat_Shock组中显著高表达

• 管家基因如ACT1，组蛋白基因HTB1等在Control组中高表达

  
  图6.不同组的marker基因：(图C)Heat_Shock组中热休克蛋白相关基因高表达；(图D)Control组的管家基因及组蛋白基因高表达

(3) 拟时序分析

作者整合了SC_15min_Rep2、SC_20min_Rep2和SC_HeatShock_Rep2三个数据集，并判断每个细胞的细胞周期阶段。

图7. 三个数据集的拟时序分析：(图A)三个数据集整合后的无监督聚类UMP图；(图B)3个数据集的无监督聚类UMP图；(图C)组合数据集的伪时间轨迹：颜色栏表示伪时间；(图D)单个数据集的伪时间轨迹

• 样本类型 映射拟时序轨迹：SC_15min_Rep2和SC_20min_Rep2存在相互重叠的轨迹，而热休克样本SC_HeatShock_Rep2发散成两个独立的分支，表明有两个不同的clsuster
• 细胞周期阶段 映射拟时序轨迹：热休克样本的两个分支几乎都由S期细胞主导。相比之下，对照样品的G1、S和G2M相大部分重叠。
• 无监督聚类的细胞类型 映射拟时序轨迹：cluster0主要来自于对照组，cluster2主要来自热休克处理组
  图8. 整合数据集的拟时序分析（3个维度）：(图A) 样本类型映射拟时序轨迹；(图B)细胞周期阶段映射拟时序轨迹；(图C)无监督聚类的细胞类型映射拟时序轨迹

热休克基因HSC82、HSP12和HSP82(图S4E)在该轨迹的两个分支之间有差异表达，表明酿酒酵母细胞对热休克处理存在异质性。

图9. 热休克蛋白基因表达的拟时序分析：采用Wilcoxon秩和检验对热休克处理样品的两个分支进行DE分析，在轨迹树图上显示了对数尺度上的表达水平

2. 白色念珠菌单细胞转录组测序

白色念珠菌做单细胞测序的难点：

• 细胞壁厚：白色念珠菌（150nm）> 酿酒酵母（120nm）
• 存在菌丝表型：会堵塞微流控通道，破坏流动和液滴的产生

作者曾测试：用于酿酒酵母单细胞测序的lysis mix未能裂解白色念珠菌细胞（在显微镜下评估），需要提高裂解试剂和酶的浓度才能完成。

2.1 白色念珠菌-Control组

2.1.1 实验设计

作者设置了3个不同的裂解时间（15min, 20min,25min），各重复两次（CA_25min_Rep2由于技术原因，没能构建文库）

2.1.2 数据分析

过滤掉 gene<220（质量差） or gene > 1600（多胞）的barcode

(1) 相关性分析

• 白色念珠菌裂解15min和20min没有太大差异（作者倾向认为20min效果好）
• 代表白色念珠菌white-phase的基因WH11高表达（white-phase：圆形，不透明，没有菌丝，具有交配能力）
• 参与糖酵解的基因TDH3高表达（在酿酒酵母中同样高表达）
• CA_15min_Rep2 和 CA_20min_Rep2相关性系数0.96，数据整合的UMAP图可以看到cluster 2,3,5与其他cluster区分较明显

图10.白色念珠菌细胞分群及高表达基因汇总：(图A)不同裂解时长gene/per cell和UMI/per cell的小提琴图：横坐标代表不同分组，纵坐标分别代表基因和UMI的定量；(图B)白色念珠菌高表达基因箱线图：横坐标代表基因在细胞中表达占比，纵坐标代表不同的基因；(图C)CA_15min_Rep2 和 CA_20min_Rep2整合数据集的UMAP图

(2) marker基因分析

• cluster3：GPI-锚定的细胞壁基因（如FGR41和PGA38）高表达
• cluster2,5：组蛋白尾部基因高表达（可能代表了由细胞周期引起的变化）
• all cluster: 编码锌指蛋白的转录因子（如STP4和ADR1）中度表达，与白色念珠菌的毒力有关；同时GNP1（一个氨基酸的跨膜转运体）在所有cluster中都表达较高

图11.不同细胞亚群的marker基因表达：(图D)cluster3的特征图；(图E)cluster2,5的特征图；(图F)所有cluster都表达的gene
图12. 不同cluster高表达gene热图

作者也将自己的scRNA-seq数据与现有公共数据集对比，群体相关性约为84%

2.2 白色念珠菌-氟康唑处理组

氟康唑是一种抗真菌药物，通常用于治疗来自各种念珠菌种类的感染。氟康唑是一种双三唑类抗真菌药物，可与细胞色素P-450结合，破坏羊毛甾醇向麦角甾醇的转化。之前有实验证明白色念珠菌面对氟康唑时存在多种反应，

2.2.1 实验设计

白色念珠菌细胞暴露于15µg/mL氟康唑3小时，在暴露前的1.5小时和3小时采集样本进行mDrop-seq检测（设置2个生物重复）。白色念珠菌菌株SC5314对氟康唑敏感，检测的MIC50为0.156µg/mL，MIC80为1.25µg/mL。（MIC50：抑制50%受试菌生长所需要的浓度）

2.2.2 数据分析

(1) 相关性分析

• 氟康唑处理的细胞普遍高表达（UMI和gene检出率高）
• 氟康唑处理组（1.5h和3h）与对照组（Control）存在分群
• 氟康唑3h处理组与对照组（Control）相关性仅为0.88

图13. 氟康唑处理组与对照组对比分析：(图A)不同处理组gene检出和UMI定量的小提琴图；(图B)replicate1的3个整合数据集的UMAP分群图；(图C)对照组和氟康唑处理3h的相关性分析：横坐标代表对照组的标准化基因表达量，纵坐标代表氟康唑处理3h的标准化基因表达量，每一个点代表一个基因

(2) marker基因分析

• 在比较对照组与氟康唑治疗1.5h和3h的处理组时，作者发现一些 麦角甾醇生物合成途径基因的表达显著上调（ERG11是氟康唑的主要药物靶点;ERG1与特比萘芬耐药性相关），这些基因的表达可以调控白色念珠菌对不同类型的抗真菌药物（如唑类和烯丙胺）的敏感性。
• 可能是由于本次实验氟康唑治疗时间较短，未检测到用于药物外排的ABC转运体。
• 氟康唑处理的细胞也显示出许多组蛋白基因的表达增加

图14. 氟康唑处理组基因表达特征一：（左图）麦角甾醇生物合成途径基因在不同组中表达量的小提琴图；（右图）组蛋白基因在不同组中表达量的小提琴图

• 一些抗原相关基因，以及面对宿主免疫应答过程种会表达上调的基因在氟康唑处理组高表达
• 热休克特异性应激反应相关基因在Control组中高表达

图15. 氟康唑处理组基因表达特征二：（左图）面对宿主免疫应答过程种会表达上调的基因在不同组中表达量的小提琴图；（右图）热休克特异性应激反应相关基因在不同组中表达量的小提琴图

• 1.5h氟康唑处理组高表达基因与酸、渗透和碱性胁迫反应相关

• 管家基因ACT1、PDA1、TDH3和PGK1的表达在不同组之间并没有显著规律

  
  图16. 氟康唑处理组基因表达特征三：（左图）1.5h氟康唑处理组高表达基因在不同组中表达量的小提琴图；（右图）管家基因在不同组中表达量的小提琴图

(3) 细胞周期分析

• 氟康唑处理组的细胞大多处在细胞周期的S期（应激状态下的细胞倾向于进入细胞周期阻滞状态）

  
  图17. 氟康唑处理组的细胞周期分析：(图B)3个整合数据集的UMAP分群图（replicate1）； (图H) 3个整合数据集的细胞周期映射（replicate1）；表格为不同细胞周期阶段的细胞数量和百分比

(4) 拟时序分析

• 对CA_Fluconazole_Rep1做无监督聚类分为9个cluster，拟时序分析轨迹与样本处理轨迹相似

  
  图18. CA_Fluconazole_Rep1的拟时序分析：(图I)3个整合数据集的无监督聚类分群图； (图J) 样本处理类型映射到拟时序轨迹； (图K)无监督聚类9个cluster的拟时序分析

3. 总结

整篇文章都是围绕实验方法展开的，主要用来验证该实验方法的可行性。并没有做过多数据挖掘的工作（可以看到使用的分析方法都很基础），仅仅比较了不同处理组的差异（好像一个bulk测序），没有去挖掘样本中细胞亚群的异质性。

酿酒酵母和白色念珠菌数据集的总结