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革兰氏染色

2019-07-09  本文已影响0人  遇见未来771

一. 原理
革兰氏染色法是细菌学中广泛使用的一种鉴别染色法,通过结晶紫和碘液媒染后,在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫和碘的复合物,革兰氏阳性菌细胞由肽聚糖网状结构交联且致密,乙醇脱色时候,肽聚糖脱水使孔径缩小,故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上,呈现紫色。革兰氏阴性菌外膜层类脂含量高,肽聚糖层较薄交联程度差,脱色后类脂外膜迅速溶解,缝隙加大,结晶紫与碘复合物溶出,因此乙醇脱色后再经过番红复染,呈红色。

二. 操作步骤
1. 涂片固定
菌液涂片时不可用于浓厚,干燥、固定。固定时通过火焰1-2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜。

  1. 染色
    一般包括初染、媒染、脱色、复染等4个步骤,具体操作方法是:
    (1)加上结晶紫后,染色1min,水洗。
    (2)加上碘液后染色1min,水洗。
    (3)加上95%酒精,摇动拨片,根据涂片厚度,脱色约20-60s,水洗,吸取水分。
    (4)加上番红后,染色1min,水洗。
    (5)吸干或在空气中晾干后,油镜镜检。
    (四个1min,一个30s)
    革兰氏染色的关键在于严格掌控酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,性菌可被误染为阳性菌。此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡的菌体自行溶解,都常呈阴性反应。
  2. 结果观察
    革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色,以均匀散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈现假阳性。

三. 注意事项
1. 标本涂片不能太厚,严格按照操作要求进行,若涂片较厚,应延长脱色试剂,直至不再出现紫色为止。
2. 玻片通过火焰温度不能太高。
3. 碘液变透明,则不能使用。
4. 水洗时动作要轻柔,严载玻片对角线方向用洗瓶冲洗,以免把菌体冲掉。
四. 感想与感悟
1. 一个载玻片做一个菌,过多,水洗和脱色时候容易混在一起。
2. 如果你做的是液体培养的菌液,可以吸取1-2μL涂片,如果你做的是平板菌落的染色,可能菌落涂不开,挑去单菌落放入50μL-100μL的稀释后,取1-2μL涂片。
3. 如果看不清菌丝状态,很多聚集在一起,是涂片过厚导致的。
4. 可以做一个阳性对照,如做一个已知的革兰氏阳性菌或者革兰氏阴性菌,确定染料是否好用。

最后,附两张我做的片子和革兰氏阳性菌和阴性菌的细胞壁图片。


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