Integrated multiomic analysis reveals comprehensive tumour heterogeneity and novel immunophenotypic classification in hepatocellular carcinomas

综合的多组学分析揭示了肝细胞癌中全面的肿瘤异质性和新型免疫表型分类

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期刊：Gut；影响因子：19.819

发表单位：浙江大学医学院等

导 读

    肝细胞癌（HCC）是世界范围内与肿瘤相关的死亡的主要原因之一，主要是由病毒感染和肝纤维化引起的。肿瘤内异质性是当前疗法在包括HCC在内的大多数类型的癌症中无效的主要原因之一，肿瘤内异质性问题在肝癌中尤为重要。尽管在基因组、表观基因组、转录组层面探讨HCC异质性的研究已经很多，但缺乏对多部位肝癌的全面和多维分析。因此，有必要在不同的干预水平上对肝癌进行全面的研究，以促进新型治疗策略的发展。

    2019年6月发表在《Gut》的一项研究中，通过整合来自8例HCC患者的42个样本的基因组、转录组、蛋白质组、代谢组等多种组学数据，分析细胞-细胞、亚克隆-亚克隆、病变-病灶和患者-患者水平的异质性，揭示了HCC肿瘤和肿瘤微环境异质性的特征，并提出了基于肿瘤免疫的新的HCC分类。这可能对指导HCC患者免疫疗法的选择具有重要意义。

摘 要

    目的：肝细胞癌（HCC）是异质性的，尤其是在多灶性肿瘤中，这降低了临床治疗的功效。在开发新的治疗策略时，了解肿瘤异质性至关重要。然而，缺乏对HCC中肿瘤异质性的全面研究，并且有关肿瘤异质性的可用证据并未导致临床实践的改善。

    设计：从8名HCC患者中收集了42个样品，并使用全外显子测序、RNA测序、基于质谱的蛋白质组学和代谢组学、细胞计数和单细胞分析评估了肿瘤异质性。进行了免疫组织化学和定量聚合酶链反应以确认基因的表达水平。三个独立的队列进一步用于验证结果。

    结果：就损伤和肿瘤的基因组、转录组、蛋白质组和代谢组而言，肿瘤异质性相当大。肝癌微环境的免疫状态异质性相对较低。针对局部免疫可能是一种合适的干预措施，具有平衡的精度和实用性。通过在HCC微环境中聚集免疫细胞，研究确定了具有免疫功能、免疫缺陷和免疫抑制功能的三种独特的HCC亚型，并进一步揭示了不同亚型的特定代谢特征和细胞因子/趋化因子表达水平。使用免疫组织化学测定CD45和Foxp3的表达水平有助于正确分类HCC患者和预测其预后。

    结论：在HCC的各个方面都存在全面的肿瘤内和肿瘤间异质性。基于结果，本研究提出了一种新型的肝癌免疫表型分类法，该分类法有助于进行预后预测，并可能支持有关治疗选择的决策。

强 调

本研究有哪些新发现？

（1）使用全外显子测序、RNA测序、基于质谱的蛋白质组学和代谢组学以及质谱分析技术，研究结果证明了肿瘤细胞在各个维度上均具有显著的异质性，而肿瘤微环境的免疫特征的异质性是可以接受的。

（2）研究发现局部免疫是治疗HCC的合适靶标，并从免疫状态，趋化因子/细胞因子和细胞代谢方面鉴定了三种具有独特肿瘤微环境的HCC亚型。

（3）在HCC微环境中，肿瘤细胞的PI3K-Akt信号传导和酮体代谢与CD8 + T细胞浸润有关。

（4）可以使用免疫组织化学，通过测试两个具有明确截断值的标志物（CD45和Foxp3）简单地概括新的免疫表型分类，显示预后预测的值和治疗选择的决策指导。

在可预见的将来会对临床实践产生怎样的影响？

（1）对HCC肿瘤异质性的全面探索为了解HCC进程和启发新型治疗策略的开发提供了有益的资源。

（2）临床上实用的分类可能对HCC患者的管理和监测有用。

研究概要

1    肝癌异质性的综合表征

    作者从8例HCC患者的21个病变（包括1个血管血栓样品）中获得了肿瘤样品，使用高通量技术来获取基因组、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和表型学（局部免疫）数据，以评估各个维度上的肿瘤异质性。为确保采样合理，并且同一区域中多种类型细胞的相互干扰会最小程度地影响结果，还补充了单细胞转录组分析，以与批量RNA-seq的结果进行组织和单细胞的比较。

2    蛋白质组学分析和拷贝数改变

    从DNA、RNA和蛋白水平上进行突变分析，发现仅有20.8%的体细胞突变在转录水平上得以表达，基因组和转录组中确认的蛋白质水平变体的数量仅9.32%。对于体细胞突变，蛋白质组变异体证实的RNA变异体比DNA变异体的可能性更高。评估了拷贝数变异（CNV）对mRNA丰度的影响，结果显示有22.5%的基因与拷贝数具有显著相关性。分析体细胞突变频率和TCGA HCC相似，并选择了HCC中的4个高频突变基因（TP53、CTNNB1、NFE2L2、ARD1A），1个癌基因（RB1）和1个抑癌基因（TSC2），描绘关键基因在组学水平上的信息传递情况。

图2，基因组改变对RNA和蛋白质水平的影响。（C）突变、CNV及其与跨病变和肿瘤的HCC相关基因的RNA和蛋白质表达的关联的热图，并标注了肿瘤分化状态。

3    HCC患者肿瘤异质性的不同维度

    作者使用基因组、转录组学、蛋白质组学、代谢组学和免疫学分析描述了病灶内、病灶间/瘤内和瘤内/患者间的异质性。基因组维度上，SNV的数量以及插入和缺失的数量在病变之间差异很大，同一肿瘤中的所有病变均具有共同的和特定的驱动突变，显示了HCC进展过程中的分支进化。在转录组方面，同一肿瘤的病变中差异表达的RNA的数量相差大约一倍，且差异表达的RNA中只有一小部分被所有病变共享，病变之间观察到高度的多样性。在蛋白质组和代谢组尺度上，在同一肿瘤的病变之间发现了显著差异，浸润免疫细胞的类型在病变和肿瘤之间也显著不同。同一病变的样本中，在空间上相距较远的组织中发现了相似的RNA、蛋白质、代谢产物和浸润性免疫细胞，表明病灶内异质性小于病灶间异质性。

4    病灶间、瘤内和瘤间异质性的比较

    基于这些多组学数据，作者进一步确定病灶间、病灶间/肿瘤内以及肿瘤间/患者间异质性的程度，这对于开发针对HCC细胞之间绝对异质性的新型抗肿瘤策略至关重要。基因组变异分析显示，病灶内异质性程度小于病灶间/瘤内异质性程度，而病灶间/瘤内异质性程度远小于病灶间/患者间异质性程度异质性。基于差异表达RNA的聚类，转录组维度上病灶内相似性不一定大于病灶间或肿瘤间/患者间相似性。基于差异表达的蛋白质和差异代谢物的聚类分析表明，所有患者在蛋白质组和代谢组方面都是独立且独特的。进一步的KEGG通路分析发现，蛋白层面结节间共有的富集通路多于转录层面，表明从转录组到蛋白质组肿瘤细胞异质性是降低的，然而意外的是代谢组层面共有的KEGG通路很少。这些结果表明，基因组和转录组层面肿瘤结节间异质性很大，而蛋白质组和代谢组层面患者特异性较大，均不适合作为HCC 治疗或干预的靶点。

图4，比较不同维度和不同层次上的异质性。（A）Jaccard评分显示病变之间和患者之间的基因组差异；（B）分层聚类的所有病变的差异表达RNA；（C）分层聚类的所有病变差异表达蛋白；（D）分层聚类的所有病变差异代谢产物；（E）差异表达的RNA、蛋白质和代谢产物的常见和特定的KEGG富集途径。

5    PI3K-Akt信号通路和酮体代谢与抗肿瘤免疫相关

    为了解肿瘤异质性背后的潜在机制，并发现肿瘤细胞与局部免疫之间的潜在关系，作者整合了基因组、转录组学和代谢组学富集分析，观察到两条KEGG途径（即PI3K-Akt信号传导途径，酮体的合成和降解）与HCC微环境中肿瘤浸润性T细胞的丰度紧密相关。PI3K-Akt信号通路富集得分高与T细胞浸润增加有关，并且参与此途径的大多数蛋白质的表达水平与T细胞丰度呈显著负相关。对于酮体代谢观察到相似的发现，其是HCC的特征性代谢。这些数据提供了肿瘤异质性的分子洞察力，并提出了新颖的机制，肿瘤细胞通过这种机制来影响HCC的抗肿瘤免疫力。

6    肝癌微环境中的局部免疫情况

    肿瘤内异质性包括肿瘤细胞异质性和微环境异质性。由于异质性程度在基因组、转录组、蛋白质组和代谢组学维度上均很明显，作者进一步使用 cyTOF检测了微环境的异质性，共计400万个免疫细胞聚类得到40簇，显示HCC免疫状况发生了显著变化，尤其是在巨噬细胞、CD8 + T细胞、调节性T（Treg）细胞和B细胞（Breg）方面。Treg细胞、Breg细胞和PD-L1-巨噬细胞与PD-1 + CD8 + T细胞正相关，它们本质上对抗原刺激的反应较弱。PD-L1 +巨噬细胞与PD-1 + CD4 + T细胞呈正相关，而树突状细胞（DC）与CD11b + CD4 + T细胞和CD11b + CD8 + T细胞呈正相关。这些结果表明，Treg细胞、Breg细胞、树突状细胞和巨噬细胞在HCC免疫微环境的调节中起重要作用。

图5，HCC病变局部免疫的详细异质性。（A）tSNE图比较了肿瘤和正常组织的局部免疫力的差异；（B）总共鉴定出40个簇，并在tSNE图中显示；（C）tSNE图以颜色标识了8种主要类型免疫细胞的标记基因表达；（D）40个细胞簇中42种免疫标记物的差异表达；G）tSNE图显示了不同患者中肿瘤的独特免疫情况；（H）不同细胞簇之间的相关性。

7    肝细胞癌的新型免疫表型分类

    使用CyTOF数据进行层次聚类，所有肿瘤样品均根据特定的标记基因表达水平形成三个簇，三种HCC亚型呈现出不同的免疫细胞谱。基于这些特征，作者将HCC亚型1、2和3分别划分为免疫功能亚型、免疫缺陷亚型和免疫抑制亚型。亚型1样品显示出相对正常的T细胞浸润水平，但浸润的B细胞（尤其是Breg细胞）较少。亚型2样品的特征是淋巴细胞浸润减少，因此DC和自然杀伤（NK）细胞的频率较高。亚型3样品显示Treg细胞、Breg细胞和M2极化巨噬细胞的频率很高，所有这些都是免疫抑制细胞。与这些发现一致的是，亚型3 HCC样品中包括PD-1，PD-L1，Tim-3和CTLA-4的免疫抑制分子的表达水平显著上调。RNA-seq数据显示，所有免疫抑制标记基因和功能基因的表达水平均被上调。重要的是，这些亚型可适用于同一患者和多患者的几乎所有HCC病变，提示病灶间异质性不会改变分类。

图6，肝细胞癌的新型免疫表型分类和不同亚型的特征。（A）根据40个聚类对所有HCC病变进行分层聚类产生了三个明显的亚型；（B）三种HCC亚型在免疫方面的差异；（C）tSNE用颜色编码以表示三种HCC亚型和正常组织中几种主要类型免疫细胞的标记基因的表达；（D）三种HCC亚型中8种主要免疫细胞的频率；（E）免疫组织化学显示免疫细胞的标记基因的差异表达；（F）5种关键类型免疫细胞中功能基因的表达。

8    新型免疫表型分类的基本原理

    作者试图了解在肝癌微环境中建立这种独特的局部免疫状态的潜在机制。与转录组和蛋白质组相比，免疫组蛋白与代谢组的相关性更好，免疫细胞的分化和功能在很大程度上取决于细胞的新陈代谢，因此作者首先探讨了三种HCC亚型之间的代谢组学差异。HCC亚型3显示出抑制的糖酵解作用和增强的线粒体呼吸作用，这归因于降低的乳酸水平和增加了参与三羧酸（TCA）循环的代谢产物。HCC亚型2显示核苷酸生物合成活性增强，而亚型1的特征是尿素循环增强。介导这些代谢过程的酶表达水平的改变与代谢物水平的改变是一致的。基于免疫表型分类的差异表达RNA的聚类表明，参与代谢调控的基因发生了显著变化，代谢途径、氧化磷酸化、乙醛酸和二羧酸酯代谢以及TCA循环，在很大程度上与代谢组学发现相符。

    考虑到浸润的免疫细胞被趋化因子和细胞因子募集，作者调查了每种HCC亚型中是否存在特征性趋化因子/细胞因子微环境。RNA-seq数据显示，HCC亚型2中除CCL14（能够募集单核细胞和巨噬细胞）外，所有趋化因子和细胞因子的表达水平都非常低，这与其免疫缺陷性质相符。在HCC亚型3中观察到VEGFA和许多其他编码肿瘤抑制趋化因子/细胞因子的基因的过表达。T细胞募集分子在亚型1和3中丰富，与其T细胞浸润程度高一致。因此，细胞因子/趋化因子微环境的特征与每种HCC亚型的免疫状况密切相关。

图7，三种HCC亚型之间肿瘤细胞代谢和细胞因子/趋化因子表达的差异。（A）代谢组学分析显示了不同HCC亚型中TCA循环、糖酵解、尿素循环和核苷酸生物合成途径的特征性变化；（B）三种HCC亚型中差异表达基因的分层聚类；（C）KEGG途径的RNA-seq数据富集显示三种HCC亚型之间的代谢发生了显著变化；（D）显示了三种HCC亚型中重要趋化因子，细胞因子和其他分泌物的表达。

9    免疫表型分类的预后作用

    作者最后探讨了HCC的免疫表型分类是否具有临床价值。招募了30例HCC患者以确认免疫表型分类，并得到了重现性结果。为了使该系统在临床上更可行，尝试了许多免疫标记，并发现CD45和FOXP3很有前景。qPCR分析证实了三种亚型中PTPRC（CD45）和FOXP3的特征表达水平。使用组织芯片，证实CD45和Foxp3表达水平的提高分别是HCC患者总体生存的保护性和有害因素，并且这三种亚型的预后不同。这表明免疫表型分类是可靠的，并且在临床上有价值。

图8，新型肝癌免疫表型分类的临床价值。（A）PTPRC（CD45）和FOXP3在三种HCC亚型中的表达；（B）显示根据标记基因PTPRC和FOXP3对HCC进行分类的方案；（C）使用HCC组织微阵列进行亚型分析的IHC染色；（D）生存曲线显示标志物基因对患者预后的预测作用；（E）生存曲线显示了不同HCC亚型的独特预后；（F）显示免疫力将是通过平衡精度和实用性来治疗HCC的合适维度。

讨 论

    使用多组学方法对肿瘤异质性的全面研究揭示了肿瘤细胞和肿瘤微环境中异质性的态势。基于这些发现，研究认为局部免疫可能是治疗HCC的合适靶标，并提出具有预后和潜在决策价值的临床实用HCC分类方案。有必要使用大量研究对象进行进一步研究，以验证该分类的临床价值。