DNA甲基化分析--------------原理到实现（一）

  DNA甲基化是表观遗传非常常见的一种表观修饰，之前写了一篇有关有意思的DNA甲基化的现象的小文章，如果有兴趣的话可以去看看：“黄金鼠饼了解一下？” --------有意思的DNA甲基化现象。
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在后续的笔记中，我们将会实战DNA甲基化分析。有的时候要知其然还要知其所以然，才能扎根生信分析，之前我跑流程，很多时候流程跑完一遍，没有什么印象，还是什么都不会，我觉得那就等于白跑了。所以扎根基本，一点点的从原理到应用才是王道呀！
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接下来我们先来了解几个小问题：

  1:DNA甲基化的是什么？它是如何形成的？

  在DNMT和SAM底物的作用下，胞嘧啶上5号碳位置加上了一个甲基，变成了5甲基胞嘧啶（可不要小看这个甲基了，非常的有用了！）

DNA甲基化的形成
图片来源：Advances in Genetics Volume 70 2010 27 - 56
  http://dx.doi.org/10.1016/B978-0-12-380866-0.60002-2

  2:DNA甲基化会有什么影响呢？

  这个问题很大，简单的来说：DNA甲基化的影响是多方面的，DNA甲基化和基因印记，干细胞分化，肿瘤的发生发展密切相关。此外，DNA甲基化可以做为肿瘤诊断的指标marker

  3:我们经常说CpG岛甲基化，什么是CpG岛？它的甲基化会对基因有什么影响呢？

1：CpG是由胞嘧啶(C)和鸟嘧组成的一个2啶(G)个核苷酸的链,当中的p是C和G之间的磷酸:
2：CpG岛就是由胞嘧啶(C)和鸟嘧啶(G)组成的串联重复序列
3：启动子区的CpG甲基化程度越高会导致基因表达沉默，甲基化程度低会使基因表达。

CpG岛及其甲基化情况影响基因表达

  4：DNA甲基化mapping是如何实现的呢？

这个问题非常的大，我们先把这个问题拆分一下去理解，我们都知道全基因组上存在着甲基化和非甲基化的DNA，首先我们来思考第一个问题：

4.1:如何去区分基因组上甲基化的C和未甲基化的C?

  现在已经有的比较成熟的，主流的分析技术方法是Bisulfite sequencing (BS-seq)，甲基化芯片技术和富集分析。

4.1.1：Bisulfite sequencing (BS-seq)
  利用重亚硫酸盐（bisulfite）这种化学试剂，对DNA进行处理。利用这种方法，它有3个特点，第一个就是它可以把未甲基化的C变成U,然后在后续PCR扩增的时候U变成了T。第二个是甲基化的C可以保持不变。第三个是基因组上其他碱基不转化。然后对甲基化后的DNA进行全基因测序

BS转化

4.1.2 甲基化芯片
  甲基化芯片的原理是基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测，亚硫酸盐处理是将非甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变，然后再将尿嘧啶转化为胸腺嘧啶（前期操作都一样）最后进行芯片杂交；对于芯片杂交来说，是要看待测的DNA序列是否可以和芯片上带有DNA探针序列匹配的情况，如果可以匹配的上的话就可以让探针发光。
  Illumina的450K芯片采用两种策略：Infinium I和Infinium Ⅱ，前者有两种bead（微珠），分别是甲基化M和非甲基化U，后者则是一种bead（不区分甲基化和非甲基化）。

芯片杂交

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1)：如图A：Infinium I，在未甲基化的GpC locus，U型bead尾部为A，与未甲基化CpG位点相匹配，能够成功进行单核苷酸延伸并被检测到（U型磁珠发光），而M型bead尾部为G，与未甲基化位点不能匹配，没有信号产生；在甲基化的GpC locus，M型bead能与甲基化CpG位点相匹配，单核苷酸延伸并产生信号（M型磁珠发光），而U型bead则不匹配，不产生信号。
2)：如图B：Infinium Ⅱ探针则不区分M和U，探针尾部为C，配对后只加入单个碱基（ddNTP-BioT， ddNTP-DNP），然后根据荧光颜色判断加入碱基的类型，进而确定该位点是否被甲基化
3)：最后，通过计算甲基化和非甲基化位点的荧光信号比例，可确定某位点的甲基化水平（Beta值=M/(M+UM)）

4.1.3富集分析
  举一个栗子来说：MeDIP-Seq（Methylated DNA Immunoprecipitation Sequencing）测序是基于抗体富集原理进行测序的全基因组甲基化检测技术。利用抗体可以特异性识别DNA甲基化的区域，从而把这个DNA序列拉下来然后进行分析。

MeDIP示意图

   那么好，假设我们得到了甲基化的DNA序列，并且也已经测序完成了，我们也都知道已经完成的测序数据里A,T,C,G都有，那么如何去判断这个序列里面甲基化的信息呢？下一个笔记我们来了解一下比对的算法！

Reference:
1:甲基化芯片入门学习-基础知识（一）
2:甲基化DNA免疫共沉淀测序原理及简介（MeDIP-seq）
3:https://www.illumina.com.cn/techniques/microarrays/methylation-arrays.html