新冠肺炎靶标汇总|结构生物信息学
新冠病毒引发的肺炎疫情在国内的传播已经基本结束，但是在世界上其他国家的感染人数却是急剧上升，近日世卫组织的专家已经宣布该肺炎成为世界性的大流行疾病。目前针对SARS-COV-2的药物开发还在持续的推进中，今天这一期就来汇总当下关于新冠肺炎药物靶标的研究进展。
首先要提到的是Spike棘突蛋白（S蛋白）。冠状病毒入侵宿主的过程要依赖于病毒表面的S蛋白的受体结合结构域（RBD）和宿主细胞表面的ACE2受体的识别，介导细胞膜的融合和内吞。S蛋白包括N端的S1亚基和C端S2亚基。近期，西湖大学周强团队解析了S蛋白和ACE2的复合物电镜结构1。在RBD和ACE2的界面上，ACE2的α1螺旋上的多个残基和ACE2的loop区形成极性作用，RBD上长长的loop区像桥梁一样跨过拱形的α1螺旋，而α2螺旋和连接β3，β4的loop区也参与了对RBD的结合。在界面的相互作用主要可以分为三个区域，桥的两端和α1螺旋的N端和C端以及一小部分的α2螺旋和loop区作用。α1的中间部分通过两个通过两个极性残基加强了结合能力。在α1螺旋的N端，RBD的Q498，T500，N501和ACE2的Q42，K353，R357形成了氢键网络。在桥的中间部分，RBD的K417，Y453分别和D30，H34作用。在α1螺旋的C端，RBD的Q474和ACE2的Q24形成氢键，RBD的F486和ACE2的M82形成范德华力。
如果，我们将SARS-COV-RBD和SARS-COV-2-RBD的结构叠合，可以看到RMSD只有0.68A，表明有很高的相似度。但是在α1的N端和中间部分，还是能发现许多突变，比如R426-N439，Y484-Q498，T487-N501，V404-K417，L472-F486等，其中V404在突变成K417以后会加强和ACE2的盐桥作用，而L472突变成F486后则会增强范德华作用，但是R426替换成N439以后则会损失ACE2的D329的盐桥作用。因此，这些残基的替换似乎能解释为什么SAR-COV特异性的RBD抗体药物对SARS-COV-2几乎没有一点活性。
蛋白界面分析软件的结果表明Q498具有较高的势能，可能是PPI上的一个热点残基2。考虑到界面宽而平坦，构效关系难以明确，而药物分子的结合能力却需要高于S蛋白和ACE2的结合能力（15.2nM）3，这使得直接靶向界面设计分子还是及其困难的，如果能通过将化合物结合在S蛋白的其他位点，从而诱导构象变化来抑制和受体的结合，这也可能是一个新的思路。
S蛋白识别的ACE2受体，以及细胞丝氨酸蛋白酶TMPRSS2也被认为是潜在靶标，它们都是病毒侵入宿主起始阶段的关键分子。在受体识别过程中，S蛋白的S1亚基的RBD经历了类似铰链的构象转变从向下转变为向上，从而暴露出能被ACE2识别的部分。而目前已经有一些能靶向ACE2的药物，包括卡托普利（Captopril），异丙酚（Propofol），甲羟喹（Tiliquinol），还有一些多肽和抗体药物，只是其抗SARS-COV-2活性还未知4。由于ACE2在全身多个器官中都有表达且其具有运输物质的正常生理功能，药物的毒副作用必须给予足够的关注。而另一个TMPRSS2则参与启动了病毒的感染，在SARS-COV中，CatB/L和TMPRSS2共同启动了S蛋白的侵入，阻断这两个蛋白的功能可以完全抑制病毒侵入。但是只有TMPRSS2对于被感染宿主的病毒传播和致病是不可缺少的。而SARS-COV-2同样利用TMPRSS2来完成侵入，并且有研究表明TMPRSS2的抑制剂卡莫司他（Camostat）甲磺酸盐可以抑制SARS-COV-2对肺部的感染，且没有细胞毒性5。
另一个重要的靶标是3CLpro（又叫Mpro，一种半胱氨酸蛋白酶），它是病毒基因组中的两个蛋白酶之一（另一个是PLpro），是冠状病毒复制酶聚合蛋白的组成部分，通过水解两个复制酶pp1a和ppab，在病毒复制和转录起着重要的作用。它能够裂解pp1a和ppab聚合蛋白上至少11个结构域间的位点，最后产生单个的功能蛋白，比如RNA聚合酶，解旋酶，核酸外切酶，内切酶以及2′-O-核糖甲基转移酶6。之后，它能通过水解作用从聚合体中解离出来并且和另一个3CLpro形成二聚体。这些特点都使得3CLpro成为一个非常理想的抗病毒靶标。在此次新冠肺炎爆发后不久，科研人员就已开始了3CLpro抑制剂发现的工作，希望能从现有的上市药物中获取能够老药新用的分子。例如通过同源建模，对接和自由能计算等计算手段预测发现普卢利沙星（Prulifloxacin），Tegobuvir，奈非那韦（Nelfinavir），维帕他韦（velpatasvir），雷迪帕韦（ledipasvir）都是靶向3CLpro的潜在抑制剂7。而在2月初，我国科学家发表了3CLpro和抑制剂N3的晶体结构（PDB ID：6L7U），针对这个结构开展了一些药物筛选和设计的工作。其中加拿大的科学家利用这个结构和他们自己开发的深度对接算法从ZINC数据库的13亿个分子中筛选到1000个命中化合物8。同时，制药公司的科学家也利用生成性的深度学习网络从头设计了多个分子结构，虽然还需要化学合成和实验验证，但短时间节省成本且高效的计算方法对于目前紧迫的抗病毒药物设计是值得尝试的策略9。值得注意的是，来自德国的科学家提出了一类广谱的抗病毒（冠状病毒和肠病毒）的药物α-酮酰胺类化合物，晶体结构显示这类分子可以结合在SARS-COV和HCOV的Mpro，以及柯萨基病毒的3Cpro的活性位点，其中最好的分子11r对冠状病毒和肠病毒具有非常高的活性，特别地，在Huh7细胞系上，11r对MERS冠状病毒的抑制活性可达400pM，作者最后也提到希望这个分子能够对新冠病毒有高活性10。
但是，也有相关研究人员对这个靶标的前景感到悲观，他们认为SARS-COV 3CLpro的抑制剂可能无法在SARS-COV-2上起效因为活性位点的形状和大小都不一样，而口袋的较大的柔性将会阻碍药物的结合，他们还模拟了SARS-COV-2的3CLpro今后进化过程中的可能发生的突变，发现其中一部分可以稳定蛋白结构，但却可能影响抑制剂进入活性位点的能力11。
和3CLpro类似的，PLpro也是在病毒复制中负责水解病毒聚合酶以及宿主蛋白的的肽键的半胱氨酸蛋白酶，但它还是一个去泛素化酶，能通过劫持细胞的泛素系统来抑制宿主的抗病毒反应。PLpro的晶体结构还未发布，目前相关的药物发现工作还是基于同源建模的结果。
例如，埃及的科学家利用SARS-COV的高分辨PLpro晶体作为模板来预测结构，并且用对接预测了一些抗SARS-COV的PLpro和抗HCV的NS3的药物对新冠病毒PLpro的结合能力12。而同样还有研究利用同源建模的结构筛选了ZINC数据库中2525个FDA上市药物，发现16个有很强亲和力的分子13。而我国的科学家还从传统天然化合物中用ADME过滤结合分子对接获得7个能结合PLpro的分子，并从中草药库中查询到含有这些成分的中药14。总的来说，有关这个靶标的药物设计还处于非常早期的阶段。
RNA依赖的RNA聚合酶（RdRp）是负责病毒复制的关键酶，包括Nsp12，Nsp7和Nsp8，是病毒复制转录的必要蛋白。在SARS-COV中，Nsp7是病毒复制聚合酶中的组成部分，结合在Nsp12共同参与复制，而Nsp12需要和Nsp7和Nsp8结合才能激活长链RNA的复制功能。有研究人员将Nsp12/Nsp7的界面和Nsp12/Nsp8的界面作为靶点对接了筛选了30000个小分子，通过对对接结果的分析，他们建议测试其中7个分子的抗SARS-COV-2活性15。而在另一项研究中，作者针对Nsp12的催化中心来进行筛选，并结合ADME，类药性和毒性筛选过滤后获得了17个命中分子，进一步动力学模拟研究表明其中3个分子的具有较好的结合能16。虽然通过序列比对显示SARS-COV-2的Nsp12，Nsp7和Nsp8和SARS-COV比有超过95%的相似性，但其关键位置的突变可能会对药物设计具有启示意义，所以可能还需等待其复合物的晶体结构的发布。
其他靶点包括Nsp13解旋酶，核衣壳蛋白（N蛋白）。其中解旋酶的NTP催化中心可以作为药物靶点，而N蛋白的RNA结合结构域的晶体结构刚刚被解析出来，其核酸结合位点也可以设计小分子17。如果总结一下，新冠病毒药物的靶标主要可以分为两大类，一类是和病毒识别侵入相关的蛋白（如S蛋白，ACE2，TMPRSS2），另一类是和病毒复制转录相关的蛋白（包括3CLpro，RdRp等）。第一类的靶标如ACE2和TMPRSS2已报道过了多个抗体和抑制剂分子，而在此基础上进行筛选和结构优化可能是一个努力的方向。相比前者，靶向第二类蛋白设计药物能够达到病毒灭活的目的，因此能更有效地杀伤病毒，但不得不考虑病毒进化过程中突变的产生对药物结合的影响。总的来说，从头设计还需要很长的一段时间，如果能合理运用计算手段和实验验证，相信能够加速这一过程。
参考文献：
(1) Yan, R.; Zhang, Y.; Guo, Y.; Xia, L.; Zhou, Q. Structural Basis for the Recognition of the 2019-NCoV by Human ACE2. bioRxiv 2020,2762 (March), 2020.02.19.956946. https://doi.org/10.1101/2020.02.19.956946.
(2) Tuncbag, N.; Keskin, O.; Gursoy, A. HotPoint: Hot Spot Prediction Server for Protein Interfaces. Nucleic Acids Res. 2010. https://doi.org/10.1093/nar/gkq323.
(3) Tian, X.; Li, C.; Huang, A.; Xia, S.; Lu, S.; Shi, Z.; Lu, L.; Jiang, S.; Yang, Z.; Wu, Y.; et al. Potent Binding of 2019 Novel Coronavirus Spike Protein by a SARS Coronavirus-Specific Human Monoclonal Antibody. Emerging Microbes and Infections. 2020. https://doi.org/10.1080/22221751.2020.1729069.
(4) Sinica, A. P. Strategies for the Development of Drugs Targeting Novel Coronavirus. 2020.
(5) Markus Hoffmann, 1, 13*Hannah Kleine-Weber, 1, 2, 13, Simon Schroeder, 3, 4Nadine Krüger, 5, 64Tanja Herrler, 7Sandra Erichsen, 8, 9Tobias S. Schiergens10, Georg Herrler, 5Nai-Huei Wu, 55Andreas Nitsche, 11Marcel A. Müller, 3, 4, 12Christian Drosten, 3, 4, 14*. SARS-CoV-2cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2 and Is Blocked by a 1clinically-Proven Protease Inhibitor. Cell 2020, 1–10. https://doi.org/10.1016/j.cell.2020.02.052.
(6) Contini, A. Virtual Screening of an FDA Approved Drugs Database on Two COVID-19 Coronavirus Proteins. 2020.
(7) Tahir, M.; Alqahtani, S. M.; Alamri, M. A.; Chen, L. Structural Basis of SARS-CoV-2 3CL pro and Anti-COVID-19 Drug Discovery from Medicinal Plants. 2020, No. February, 1–26. https://doi.org/10.20944/preprints202002.0193.v1.
(8) Gentile, F.; Cherkasov, A. Rapid Identification of Potential Inhibitors of SARS-CoV-2 Main Protease by Deep Docking of 1.3 Billion Compounds Computational Drug Discovery of DNA Repair Inhibitors View Project Molecular Modeling of Small Molecule Interactions with the TLR7 Receptor View Project. 2020. https://doi.org/10.26434/chemrxiv.11860077.v1.
(9) Zhavoronkov, A.; Aladinskiy, V.; Zhebrak, A.; Zagribelnyy, B.; Terentiev, V.; Bezrukov, D. S.; Polykovskiy, D.; Shayakhmetov, R.; Filimonov, A.; Orekhov, P.; et al. Potential 2019-NCoV 3C-like Protease Inhibitors Designed Using Generative Deep Learning Approaches. 2020, No. February. https://doi.org/10.26434/CHEMRXIV.11829102.V1.
(10) Zhang, L.; Lin, D.; Kusov, Y.; Nian, Y.; Ma, Q.; Wang, J.; von Brunn, A.; LEYSSEN, P.; Lanko, K.; Neyts, J.; et al. Alpha-Ketoamides as Broad-Spectrum Inhibitors of Coronavirus and Enterovirus Replication Structure-Based Design, Synthesis, and Activity Assessment. J. Med. Chem. 2020. https://doi.org/10.1021/acs.jmedchem.9b01828.
(11) Góra, A. Molecular Dynamics Simulations Indicate the COVID-19 Mpro Is Not a Viable Target for Small-Molecule Inhibitors Design. 2020.
(12) Elfiky, A.; Ibrahim, N. S. Anti-SARS and Anti-HCV Drugs Repurposing against the Papain-like Protease of the Newly Emerged Coronavirus (2019-NCoV). Res. Sq. 2019. https://doi.org/10.21203/rs.2.23280/v1.
(13) Arya, R.; Das, A.; Prashar, V.; Kumar, M. Potential Inhibitors against Papain-like Protease of Novel Coronavirus (SARS-CoV-2) from FDA Approved Drugs. Chemrxiv.Org No. February 2020. https://doi.org/10.26434/chemrxiv.11860011.v2.
(14) Zhang, D.; Wu, K.; Zhang, X.; Deng, S.; Peng, B. In Silico Screening of Chinese Herbal Medicines with the Potential to Directly Inhibit 2019 Novel Coronavirus. J. Integr. Med. 2020. https://doi.org/https://doi.org/10.1016/j.joim.2020.02.005.
(15) Ruan, Z.; Liu, C.; Guo, Y.; He, Z.; Huang, X.; Jia, X. Potential Inhibitors Targeting RNA-Dependent RNA Polymerase Activity ( NSP12 ) of SARS-CoV-2. 2020, No. March. https://doi.org/10.20944/preprints202003.0024.v1.
(16) Mirza, M. U.; Froeyen, M. Structural Elucidation of SARS-CoV-2 Vital Proteins : Computational Methods Reveal Potential Drug Candidates against Main Protease , Nsp12 RNA-Dependent RNA Polymerase and Nsp13 Helicase. 2020, No. March. https://doi.org/10.20944/preprints202003.0085.v1.
(17) Fifth, T.; Hospital, A.; Fifth, T.; Hospital, A.; Medica, M.; Fifth, T.; Hospital, A. Crystal Structure of SARS-CoV-2 Nucleocapsid Protein RNA Binding Domain Reveals Potential Unique Drug Targeting Sites; 2020.
