2021-08-08 基于mRNA display技术的蛋白质-

        前面我们介绍了mRNA display的方法原理，今天分享的这项研究就是基于mRNA display开发用于蛋白质-蛋白质互作鉴定的PROPER-seq方法。  传统针对蛋白质-蛋白质的互作鉴定多依赖于蛋白质质谱的鉴定，而PROPER-seq将蛋白质-蛋白质互作的的鉴定转换为RNA-RNA的嵌合鉴定，通过高通量测序可以实现大规模的蛋白质-蛋白质互作鉴定。

PROPER-seq

三言两语

1.SMART-display的开发：mRNA-display首先需要建立比较完整mRNA库，在Proper-seq中，研究中基于SMART-seq模板置换的策略进行mRNA文库的构建，然后通过PCR将T7 promoter，Puromycin linker hybridization sequence引入其中。

2. 使用T7 RNA polymerase进行体外转录，然后将含有Puromycin 修饰的linker（同时带有biotin修饰）与转录RNA退火杂交，得到mRNA翻译模板。采取体外翻译策略进行蛋白质合成，在蛋白质合成至mRNA3'端时，Puromycin作为tRNA类似物参入其中，形成蛋白质-mRNA嵌合复合物。

3.Bait文库：将得到的蛋白质-mRNA嵌合复合物通过Biotin固定在链霉亲合素树脂上，对蛋白质上的mRNA进行逆转录，同时依靠模板置换反应引入BbvCI酶切位点（逆转录合成的cDNA和用于模板置换的TSO为dsDNA），使用Bbv CI进行酶切，获得黏性末端，其可以与具有互补配对黏性末端的接头进行连接。

4.Prey文库：将得到的蛋白质-mRNA嵌合复合物通过Biotin固定在链霉亲合素树脂上，对蛋白质上的mRNA进行逆转录，同时依靠模板置换反应引入BbvCI酶切位点（逆转录合成的cDNA和用于模板置换的TSO为dsDNA），使用Bbv CI进行酶切，获得黏性末端。Prey文库的Puromycin 修饰的linker上有一个脱氧次黄嘌呤核苷酸，使用Endonuclease V可以将文库从链霉亲合素树脂上释放，从而得到prey文库。

5.将Bait文库和Prey文库混合孵育，依靠蛋白质-蛋白质相互作用，Bait文库捕获相应的Prey文库，经过T4 DNA连接酶将二者的进行嵌合连接后，对文库进行片段化与捕获，然后测序。基于RNA-RNA嵌合序列即可以推测蛋白-蛋白互作。

PS.PROPER-seq方法是一种纯体外的实验方法，使用的蛋白质翻译系统也是E.coli来源的，因此在解析蛋白质-蛋白质互作时存在一定的局限性。

Ref

Johnson, K. L. et al. Revealing protein-protein interactions at the transcriptome scale by sequencing. Mol Cell (2021).