科普讲堂|Ion torrent测序基本原理介绍

二代测序技术（NGS）作为精准医疗的核心，已被广泛应用于临床和科研中，该技术使得我们对基因组有了更全面的了解，从而能够帮助医生为病人制定更合适、更有效的治疗方案。Ion Torrent作为NGS领域主要测序平台之一，目前已经被广泛应用。那今天小编带大家了解Ion Torrent测序的原理。

一、原理概述

Ion Torrent平台采用半导体芯片测序原理，使用了一种高密度半导体小孔芯片，该芯片置于一个离子敏感层和离子感受器之上，每当有核苷酸分子被掺入时就会释放出质子，而离子感受器就会感受到这种信号，知道是哪一个核苷酸被掺入，从而读出DNA序列。

二、优势&缺点

优点：无以伦比的快速，2个小时完成测序工作；Ion Torrent的化学测序原理自然简单，无修饰的核苷酸、无激光器或光学检测设备，因而可达到极小的测序偏差和出色的测序覆盖均衡度。

缺点：测序通量目前还不够大，增加半导体芯片的容量将有望提高测序仪的处理能力。

三、实验流程

1. 建库过程

建库是在样本DNA片段的两端加上标准的接头。Ion Torrent的建库接头不同于Illumina建库接头，它的接头不是3’端带有突出的T碱基粘性末端，而是平头的。

建库添加接头

在加接头的过程当中，加入P1接头，并同时加入X接头或者A接头。其中，P1接头是连到测序珠子的这一端。而X或A接头是未来的测序起始端。X接头和A接头的差别是带有Barcode序列的，而A接头是不带有Barcode序列的。

A接头和X接头的区别

用A接头的好处是可以直接测到样本，这样对于充分利用测序的读长是更好的，但是它的缺点是没有Barcode，所以一张芯片只能放一个样本。用X接头的好处是可以把一个芯片的测序通量分配给几个文库，测完序之后用Barcode把不同的文库给分开。

在IonTorrent测序当中，AmpliSeq文库是一种非常常见的文库，AmpliSeq文库是通过多重PCR扩增出来的DNA，再加上接头做的文库。如果把整个的PCR扩增产物都拿来测序，那么测到的两头的20～30个碱基，都会是PCR引物的序列，而PCR引物是人工设计的，它的序列是已知的。那就会浪费相当大一部分的测序读长和测序数据量。为了解决这个问题，在设计AmpliSeq的PCR引物的时候，在这个引物上特别设计了一种化学修饰。而这种化学修饰可以被PuFa试剂所切断，这样利用PuFa试剂把PCR扩增产物上大部分的引物序列都给切掉，在测序的时候就可以尽可能多得测到样本序列。

去除PCR引物

2. 乳液PCR

在做好文库之后，接着就是把文库种到测序珠子上去，并且进行扩增。Ion Torrent把文库种到测序珠子上去的方法，是做油包水PCR，也叫emulsion PCR（乳浊液PCR）。油包水PCR包括两个相：油相和水相。其中水相是核心，油相起到分隔作用。

水相中包括了：文库、引物、酶、Master Mix、测序珠子这5种PCR反应的主要成分。其中这个测序珠子，是接下来测序的核心载体。这些珠子的表面，共价连接了许多的PCR引物，这个引物的序列正好是和文库的P1接头是互补的，每一个油包水PCR都会包含许许多多个这样的小的测序微珠。水相中的另外一个成分是那个游离的PCR引物，这个游离的PCR引物，它的5’端标记了生物素（标记的生物素的作用，后面还要提到，），这个引物的序列是和前面的A接头或者X接头相一致。 

测序珠子表面共价连接了许多PCR引物

把水相混合好之后加入油，把油和水进行混合，接着，把混合好的乳浊液进行PCR反应，PCR反应的结果是一个小水滴中，如果它同时有文库分子和测序微珠，那么它就会发生PCR反应，如果缺少文库分子或者测序微珠，就不会发生PCR反应。

PCR反应之后，珠子的表面就会长出同一个液滴当中，所含的DNA（文库）分子的扩增拷贝来。这些扩增出来的DNA链是通过共价键连到珠子上的。这个共价连接，可以保证在接下来的测序过程当中，这些连到珠子上的DNA链，不会被（液流）冲走。那么这些DNA链就可以作为稳定的测序模板。

乳液PCR扩增结果

油包水PCR完成了之后，要把所有的珠子当中那些发生了PCR反应的珠子给纯化出来。纯化的手段是通过用链霉亲和素的磁珠和刚才经过PCR扩增反应的珠子进行混合。那些发生了PCR反应的珠子它上面的DNA链是连了一个从PCR扩增引物带来的生物素，生物素会和链霉亲和素很牢固地结合，这样磁珠就会和发生了PCR反应的测序珠子结合在一块。而那些没有发生PCR反应的珠子上面没有连接着生物素，所以，它不会和磁珠结合。

接下来用磁铁进行吸附，磁铁吸附磁珠，磁珠会把带了生物素同时带了扩增了的DNA链的那些测序珠子给富集起来。而那些没有和磁珠结合的微珠，留在上清液当中，通过清洗就被洗掉了。然后通过专门的洗脱液，把磁珠所富集起来的测序珠子给洗脱下来，这些洗脱下来的珠子，就可以上机测序了。

3. 测序过程

Ion Torrent 测序仪是第一个不需要光学系统的商业测序仪，采用半导体测序，通过半导体芯片直接将化学信号转换为数字信号。

Ion torrent 半导体测序芯片内进行测序反应

在半导体的芯片上有很多的小孔，每个小孔正好可以容纳一个测序微珠。这些小孔可以感受微环境的PH值变化。在测序过程中，DNA 模板链已被固定在这些微球上，然后按顺序投递四种核苷酸，DNA 聚合酶以DNA 模板链为模板，遵循核苷酸互补配对规则，若核苷酸掺入并且发生结合，就会产生 H+（氢离子），而在每个孔的底端都有一些传感器，这些感应器能够检测到 H+浓度并将其转换成数字信号，实时解读核苷酸序列。

Ion Torrent 直接检测氢离子，无需荧光检测 解读核苷酸序列，输出记录相应碱基

如果检测DNA链上有两个相同的碱基，检测到的电压双倍，芯片则记录两个相同的碱基。

两个相同的碱基，检测到双倍电压

例如流入的是dCTP溶液，而模板上正好有一个G碱基。就会发生聚合反应，并产生电压变化，而且会被记录下来。如果流入的溶液与模板上的碱基不匹配，就不会发生聚合反应。也就没有电压变化，不会有碱基被记录下来。在测序的序列安排上，最前面的4个碱基叫Key sequence，分别是A、C、G、T，因为每个珠子上长多少个DNA链，它的变化范围是很大的。所以用Key Sequence的A、C、G、T四个碱基所测到的PH值变化的强度来确定这个珠子的信号强度。

有了标准的信号强度之后，后面测到的信号会和这4个信号强度做对比。如果是一倍的强度，我们就知道有一个碱基。如果有2倍的碱基，就知道串联了两个相同的碱基。依次类推。

芯片上几十万、几百万甚至上千万个DNA片段同时读取序列信息

以上就是IonTorrent系统的测序原理，其将简单的化学过程与成熟的半导体技术相结合，简化了测序过程，使得测序流程更快速，更具扩展性，也更加普及。在医学及临床诊断，包括肿瘤、妇婴生育保健、HLA分型以及病原微生物检测等领域被广泛应用。

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