Taq DNA聚合酶的应用与改造历程
我为什么写这篇文章？
Taq DNA聚合酶是第一代热稳性的DNA聚合酶，说实话我觉得Taq DNA聚合酶确实“老了”，应该被更优秀的“后来者”替代，在有些领域也确实如此，这是技术进步的必然，没什么可惜的。但是，人们似乎对“第一代”总有一种特别的眷恋，Taq DNA聚合酶从没出现过“将被淘汰”的危机。野生型的Taq确实失去了光环，但各种各样的突变体“前赴后继”，继续在现代生物学领域发挥着重要作用。本文是出于个人的兴趣，对Taq DNA聚合酶作了一个综述性回顾，即致敬那些为Taq DNA聚合酶的应用和拓展作出卓越贡献的科研人员，也为Taq DNA聚合酶研发同行提供一个参考。本文罗列了一些Taq DNA聚合酶的突变体，它们都在某些方面被赋予更”好“的性能，文末提供了这些突变体的序列，点击直达。
引言
1986年，Mullis先生正式公布了PCR技术的论文（Mullis, 1986），从此开启了现代分子生物学的大门。当时，由于使用的是大肠杆菌聚合酶I（Klenow），每个循环都需要补充新的聚合酶，操作十分麻烦。1988年，Saiki等（Saiki, 1988）将一种从Thermus aquaticm分离出的耐热型DNA 聚合酶用于PCR技术，成功完成了DNA的自动扩增，这个聚合酶就是“大名鼎鼎”的Taq DNA聚合酶。Taq DNA聚合酶的发现，使PCR变成一种便利的、普遍的实用分子生物学技术。
30多年来，越来越多的其它的优秀的耐热型DNA聚合酶用于PCR技术，比如Pfu系列、Vent系列、KOD系列，但Taq DNA聚合酶始终是PCR聚合酶的主力军。到目前，Taq仍然是市场份额最大，种类最繁多，应用最广泛的热稳型DNA聚合酶。Taq聚合酶缺乏3’-5’校正活性，但具有5’-3’外切活性和末端加A的特点，在sanger测序、qPCR、TA克隆等领域具有独特的应用。同时，研究人员对Taq DNA聚合酶的改造也从未停止，这正是Taq DNA聚合酶在PCR应用中生生不息的根本动力。下面，我就来介绍一下Taq DNA聚合酶的应用及改造历程。
Taq DNA 聚合酶的来源
Taq DNA聚合酶是从一种叫做水生栖热菌（Thermus aquaticus）的嗜热细菌中分离出来的（Chien, 1976），这种细菌是从美国黄石国家森林公园的火山温泉中分离得到的，生长在70-75℃极富矿物质的高温环境中（Brock, 1969）。因此，Taq DNA聚合酶具有极高的热稳定性，或许能够承受PCR的热变性步骤。1988年，Saiki等将Taq DNA聚合酶用于体外PCR扩增，不但实现了PCR自动化，还因为提高了退火和延伸温度而提高了产物特异性。这个研究鼓励了更多的技术人员使用Taq DNA聚合酶进行PCR，1989年，Lawyer等利用特异性探针从Taq DNA聚合酶基因文库中钓取了Taq DNA聚合酶全长基因，最终得到一个2499bp的编码序列，GC%高达68%，他们将该基因克隆到大肠杆菌中，通过诱导表达和分离纯化得到纯的Taq DNA聚合酶。
Taq DNA 聚合酶的特点
Taq DNA聚合酶全长832aa，相对分子量94KD，预测的等电点约为6.0，理论总平均亲水指数为-0.282。现将其酶学特点罗列如下：
① 良好的耐热型，最适催化温度在75-80℃，95℃半小时后仍保留50%以上的活性。Taq DNA聚合酶是Mg2+依赖型聚合酶，最适浓度范围是2-4mM。Taq DNA聚合酶还需要单价阳离子，在10-55 mM KCl中具有最大活性。有研究认为Na+会抑制聚合酶活性，但有些研究中聚合酶在Na+环境中也能够正常扩增。
② 5'-3'聚合活性，该特性对温度具有较高的敏感性，70℃时，Taq DNA聚合酶能够以60nt/s的速率聚合DNA链，55℃时降为24nt/s，37℃时为1.5nt/s，22℃时基本停止扩增（Innis, 1988）。
③ 5'-3'外切核酸酶活性，Taq DNA聚合酶是少数具有这一活性的DNA聚合酶之一。1991年，Holland等（Holland, 1991）利用Taq DNA聚合酶的5'-3'外切活性切除5’端放射性标记的DNA探针，通过放射性信号的变化，实现PCR产物的特异性检测。这一研究，为qPCR技术的发展奠定了基础，从此，Taq DNA聚合酶也成了探针法qPCR技术的指定聚合酶。
④ 部分PCR产物3’末端加A，1988年，Clark等发现Taq DNA聚合酶会在新生链的3’末端添加无模板核苷酸，这一特征使Taq DNA聚合酶的PCR产物能够直接用于TA克隆。但是实际应用时，情况要复杂得多， 1993年，Hu等报道了8种聚合酶3’末端延伸的情况，发现Taq DNA聚合酶在PCR产物的3’末端添加A或其它碱基。1996年，Magnuson等系统性研究了Taq DNA聚合酶3’末端加A的概率，发现3’末端加A并不高，与反向引物5’端碱基种类密切相关，他们还指出这种不完全的碱基添加不利于在等位基因分形和TA克隆。
⑤ 无3'-5'校正活性，虽然Taq DNA聚合酶与大肠杆菌聚合酶I有很高的结构相似性（包括3’-5’外切核酸酶结构域），但它缺乏3'-5'外切核酸酶活性，这降低了其在PCR扩增中的忠实性。关于Taq DNA聚合酶的错误率，不同的报道差异很大，Tindall等（Tindall, 1988）测定的突变率为1/9000，Cline等（Cline, 1996）测定的突变率为8.0±3.9×10-6。这种差异的原因有两个：一、测试方法不同，比如lacZα和lacI，二、酶纯度和实验条件有差异。抛开这些错误率数据，实事求是的讲，我使用Taq DNA聚合酶多年，用于一般性扩增保真性还可以，一般1-2.5kb的目标片段，挑取两个克隆基本能得到正确的克隆。用于困难模板扩增时，错误率较高，挑取4-6个克隆子基本也能得到正确克隆。
(上述所列的酶的催化性能参数，在不同的研究中是有较大变化，因为可能使用的酶纯度不同，或者使用的buffer不同，模板、引物、仪器、反应体系甚至PCR管壁的薄厚都会导致PCR表现的差异。这些数据只是一个参考，实际使用中应以试验结果为准。)
Taq DNA 聚合酶的结构与功能
Taq DNA聚合酶属于聚合酶家族A，是一个单体酶，它与大肠杆菌聚合酶I（pol I）具有很高的结构同源性。1995年，Kim等公布了Taq DNA聚合酶的晶体结构，为解释其耐热性、催化活性及分子改造奠定了基础，下面将其结构特点罗列如下：
Taq DNA聚合酶的三维结构（Kim, 1995）
① Taq DNA聚合酶包括三个结构域，1-291：5'-3'外切核酸酶结构域，292-423：该结构域对应于pol I的3'-5'外切酶结构域，两者虽然具有结构相似性但无序列同源性，因此Taq DNA聚合酶不具有3'-5'外切活性，424-832：5'-3'聚合活性结构域。
② 5'-3'外切结构域是一个功能完整的独立结构域，该结构域的缺失不会使Taq丧失聚合活性，但对酶的催化性能有一些影响。Barnes（Barnes, 1992）构建了一个N端236aa缺失的Taq突变体，发现仍具有完整的聚合活性，且保真性有所提高。Lawyer等（Lawyer, 1993）发现N端289aa缺失的大片段耐热性比全长酶更高，且盐离子耐受能力也提高了，但持续合成活性降低十倍。Merkens等（Merkens, 1995）认为Klentaq持续合成能力的下降与5'-3'外切结构域结合DNA有关，结合作用阻止了酶与DNA底物的彻底解离，后来很多研究人员也支持这一观点。此外，5'-3'结构域还对Taq DNA聚合酶的底物特异性有很大影响，5'-3'结构域删除片段对引物3’端错配敏感性显著下降，对ddNTP的掺入能力增强。从三维结构上看外切结构域与聚合结构域距离很远（大于70Å），很难理解它是如何与聚合结构域协作的，Kim等也无法解释这个现象，他们推测5'-3'外切结构域在溶液中的位置与晶体中不同，要更接近聚合结构域。
③ Taq DNA聚合酶3'-5'外切酶结构域比pol I短，缺少4个长度8-27aa的loop结构，并且pol I中担负金属离子结合的关键残基D424、D501、D355、E357在Taq中被替换为L356、R405、G308、V310，酸性残基上的羧基能够与金属离子形成离子键，被替换后无法再与金属离子结合，Kim等推测这是Taq DNA聚合酶失去3'-5'外切酶活性的主要原因。
④ 5'-3'聚合活性结构域像一只右手，包括拇指(Thumb)、手掌(Palm)、手指(Fingers)结构，催化活性位点是Asp610、Asp785和Glu786位于Palm结构域中，手指结构中的O-α螺旋对底物特异性有重要作用，拇指结构中的I-α螺旋也和底物结合密切相关。
（Eom S H, 1996）Klentaq1-DNA复合物结构
Taq DNA聚合酶的应用
PCR技术改变了现代分子生物学，而Taq DNA聚合酶改变了PCR。随着技术不断的发展，PCR又细分为功能各异的种类，分别应用于不同的领域。在有些领域，比如高保真扩增，Taq DNA聚合酶被具有校正活性的酶取代，有些领域，如直接PCR、等位基因检测等领域，Taq DNA聚合酶还具有重要的应用，还有些领域，如Sanger测序、探针法qPCR、TA克隆，Taq DNA聚合酶仍不可替代，下面我就列举几个介绍一下。
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热循环PCR
Taq DNA聚合酶具有良好的热稳定性，能够承受热循环PCR的温度变化，不需要再人为的补充聚合酶，有利于自动化扩增，并且可以在较高温度下进行退火和延伸，能够提高PCR的特异性，因此被广泛采用。随着越来越多的其他来源的DNA聚合酶被发现，Taq DNA聚合酶受到了严重的冲击，不过由于Taq DNA聚合酶廉价易得，产品种类齐全，在一般的检测性PCR，插入基因鉴定，基因编辑检测等领域，仍具有十分广泛的应用。 -
易错PCR
易错PCR是一种常用的基因随机突变方法，在酶的分子改造领域具有重要应用。聚合酶在高浓度Mg2+或者Mn2+存在条件下，延伸错误率概率显著提高，所得目标产物形成含有随机突变的DNA文库。Taq DNA聚合酶因为缺乏3’-5’校正活性，正适合易错PCR技术，虽然通过功能结构域缺失，Pfu(exo-)、Vent(exo-)也可以应用于易错PCR，但大多数报道中都采用Taq DNA聚合酶。 -
热启动PCR
利用Taq DNA聚合酶进行PCR时，在较低的温度下（20-40℃）酶仍具有一定的聚合活性，此时引物容易非特性退火，因此容易产生干扰产物，甚至导致目标序列扩增失败。1991年，D'Aquila等发现将PCR试剂与模板分别加热到较高温度再混合，能够提高PCR产量及专一性，为热启动PCR奠定了基础。1994年，Sharkey等（Sharkey, 1994;Scalice, 1994）发现一种抗体TP7，能够在低温下抑制Taq DNA聚合酶，高温变性后完全释放出Taq DNA聚合酶的活性，明显降低了非特性扩增的发生。后来，研究人员又发现了冷敏感的Taq DNA聚合酶突变体，在低温下活性极低，高温下又能够正常扩增。研究人员还发明了类发卡引物、双链引物、热活性引物，避免引物提前退火，进一步减少了PCR 的非特异性扩增。Taq DNA聚合酶热启动产品，目前在市场上还有很大占比，而且为其他DNA聚合酶的同类产品研发提供了思路。 -
位点特异性PCR（SNP检测）
3’-5’校正活性的缺失限制了Taq DNA聚合酶的应用，但这种缺陷使Taq DNA聚合酶正好可以用在单核苷酸多态性（SNP）检测上。1992年，Huang等发现Taq DNA聚合酶因为缺乏3’-5’校正活性，在扩增3’端错配引物时，效率显著降低（见下图）。
（Huang M M, 1992）引物/模板错配（横坐标）与延伸效率（纵坐标）
在进行SNP检测时，只要把引物3’端设计在等位基因处，匹配的模板能够正常扩增，不匹配的模板就无法扩增或产量很低，根据核酸电泳或者qPCR检测，进行基因型区分。不过这种方法也有缺陷，虽然有些错配（比如A/C、T/G）延伸效率降低，但仍能产生PCR产物，干扰检测结果，研究人员对此进行了一系列的改进优化，准确性得到了很大的改善（Ahmadian, 2001; Germer, 2003; Gaudet, 2009）。不过由于测序技术的普及，用测序法进行基因分型和SNP检测更加准确，但更高的成本、耗时等缺陷还是有一定限制，基于Taq DNA聚合酶的PCR/qPCR试剂盒在该领域发挥着主要作用。
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qPCR（Taqman法）
qPCR按照检测模式的不同可以分为荧光染料法、Taqman探针、分子信标和双杂交探针，分子信标本质上也是一种探针，本文将其和Taqman统称为探针。荧光染料法是基于SYBR green I与dsDNA的无差别结合，因此(SYBR)qPCR对DNA聚合酶基本没有要求，探针法基于聚合酶5’-3’外切活性对5’端荧光报告基团的切割，因此只能用Taq及其衍生酶。
（Taqman）qPCR与（SYBR）qPCR的区别
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TA克隆
向PCR产物3’端无模板依赖添加脱氧核糖核苷酸不是Taq DNA聚合酶特有的性质，测序酶、pol I（强），Vent（弱）都有这个特点，但适合耐热性PCR的只有Taq系列。前面已经做过介绍，Taq DNA聚合酶3’末端加的不一定都是A，而且概率也不高，跟反向引物的5’端碱基有关，但PCR产生的巨大数量的拷贝能够确保每一种基因型产物都得到有效克隆，在TA克隆应用上Taq DNA聚合酶仍然无法替代。 -
Sanger测序
Sanger测序又称第一代DNA测序，其特点是通过掺入ddNTP使DNA链终止延伸，产生不同断点的条带，经过凝胶电泳分析，即可确定四种碱基在DNA链中位置。1977年，Sanger先生使用该技术完成了一个五千多碱基对的DNA序列测定，开启了核酸测序的新时代。
Sanger最早的测序酶是大肠杆菌pol I Klenow片段，效果并不太好，后来发现了来源于T7噬菌体的T7 DNA聚合酶，它掺入ddNTPs的能力比pol I和Taq优秀的多，通过氨基酸删除降低其3’-5’外切活性，具有极高的持续合成能力，是一个优秀的测序酶（Tabor, 1987; Tabor, 1995）。但是T7 DNA聚合酶是一个常温酶，不适合耐热型PCR，特异性不好。研究人员自然想到了耐热的Taq DNA聚合酶，然而野生Taq酶在Sanger测序中的表现并不理想，主要有两个问题：1.野生型Taq掺入ddNTP的活性很低，无法产生足够强度的测序谱带。2.掺入ddNTP的速率不均匀，Taq野生酶及突变体极显著的偏好ddGTP掺入。
第一个问题率先被Reeve等（Reeve, 1995）解决，他们发现位于O-α螺旋（该结构处于活性口袋区，一般活性口袋的苯环结构都是值得关注的残基）中的F667对ddNTP掺入十分重要，F667Y显著提高了酶的ddNTP掺入能力。后来，Vander等（Vander, 1997）将Klentaq(F667Y)突变体与一种耐热型无机焦磷酸酶配合，测序性能更加优秀。不知道Life公司大名鼎鼎的BigDye是不是在此基础上研发的，BigDye中的ddNTP是被不同的荧光染料标记的，比ddNTP具有更大的空间位阻，可能需要更多的突变。第二个问题，1998年被Li等（Li, 1998; Li, 1999）解决，为了调查掺入ddGTP偏好的原因，他们结晶了Klentaq1-DNA-ddNTP三元复合物。数据揭示了精氨酸残基660（R660）的胍基侧链与传入的ddGTP的鸟嘌呤碱基的O6/N7原子之间的选择性相互作用，用带负电荷的天冬氨酸取代R660残基完全消除了ddGTP掺入的偏好，R660D/F667Y双突变体大大提高了染料终止法的测序质量和准确性。
Vander Horn P B, 1997
大肠杆菌pol I是第一代Sanger测序酶，存在较多缺陷，因此很快被取代；T7 DNA聚合酶是第二代，测序表现比较优秀，也曾闪亮一时；Taq DNA聚合酶是第三代，因其热稳定性成为最有潜力的测序酶，经过不断的改造和进化，Taq已经成为成熟的商业化测序酶，并长期“霸占”Sanger测序领域。
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二代测序
二代测序又称下一代测序（NGS），是近十几年迅速发展起来的一种测序技术，2014年开始风靡中国，势头很猛，大有取代Sanger测序的趋势，但Sanger测序仍发挥着不可替代的作用。NGS取得了巨大成功，就像illumina公司的Chen Cheng-Yao（Chen, 2014）说的，NGS技术彻底改变了现代生物学和生物医学研究，负责这项创新的引擎就是DNA聚合酶。DNA聚合酶在NGS技术中的应用包括两个方面：1、作为测序酶，2、作为建库试剂。
（Guo J, 2010）在SBS方法中，使用固定化的DNA模板构建芯片，该模板能够自引发聚合酶反应。设计了四个核苷酸类似物，使得每个核苷酸类似物在碱基的特定位置上都标记有独特的荧光染料，并具有一个小的化学基团（R）来封端3'-OH基团。加入四个核苷酸类似物和DNA聚合酶后，聚合酶仅将与模板上下一个核苷酸互补的核苷酸类似物掺入芯片的每个斑点上（步骤1）。去除多余的试剂并洗掉所有未结合的核苷酸类似物后，使用四色荧光成像仪对芯片表面进行成像，并在芯片的每个点上从核苷酸类似物上的特定染料发出独特的荧光发射将产生核苷酸的身份（步骤2）。成像后，自引发模板部分上的少量未反应的3'-OH基团将被过量的3'-O-修饰的核苷酸可逆终止子和DNA聚合酶封闭，以避免干扰下一轮合成（步骤3）。染料部分和R保护基将被去除，以高产率产生游离的3'-OH基（步骤4）。通过重复步骤1、2、3和4以鉴定模板DNA的下一个核苷酸序列，在此阶段，芯片上的自引发DNA部分准备用于下一个反应周期。
NGS技术的特点是边合成边测序（SBS），它使用一种可逆的的染料终止剂（脱氧核糖的3'-OH位置与荧光团之间，包含可裂解的化学基团，荧光信号被采集后通过化学方法去除荧光基团，新暴露的3'-OH能够继续聚合碱基），在测序过程中可以被清除，不会终止延伸反应。Klentaq(R660D/F667Y)突变体对这种染料活性不高，所以适用于Sanger测序的Taq酶并不适合NGS。NGS早期采用的是 9oN polymerase(exo-) A485L/Y409V突变体。不过，科研人员并没有放弃Taq DNA聚合酶，Leconte等（Leconte, 2010）通过定向进化得到一个突变体Taq 197，掺入可逆性标记脱氧核糖核苷酸的能力比Klentaq突变体显著提高。Chen等（Chen F, 2010）通过定向进化得到一个突变体，掺入dNTP-ONH2能力显著提高。遗憾的是Taq DNA聚合酶最终并没有被广泛用于NGS。
文库构建是NGS技术中最重要的步骤，而构建文库最重要的酶就是DNA聚合酶。建库要求酶具有极高的均一性和扩增效率，能够扩增高GC、高AT等复杂模板，WGS/WES、变异检测等对保真性也有较高要求。在这个方面，Taq DNA聚合酶依然没有Vent、Pfu、KOD等保真酶应用广泛。在特殊的测序领域，如甲基化测序，DNA经过重亚硫酸盐在高温、酸性条件下转化后会产生dC-dU碱基变换和碱基损伤，保真酶难以扩增，Taq DNA聚合酶成了不错的选择。Millar等（Millar, 2015）通过定向进化得到一个突变体5D4，能够绕过重亚硫酸盐处理DNA的dU碱基和损伤碱基。当然Pfu(exo-)等通过定向进化在这方面也取得了成功，因此对于NGS技术，Taq DNA聚合酶的应用并不普遍。至于第三代新型测序技术，主要以φ29 DNA聚合酶为主导，Taq DNA聚合酶在新兴测序领域似乎渐渐没落了。
Taq DNA聚合酶的改造
Taq DNA聚合酶发现了几十年，不但没有被取代，反而在分子生物学领域具有越来越广泛的应用。这一方面依赖于它自身的功能和特点，另一方面也依赖于研究人员对其不断的进化与改造。通过定点突变、结构域重组、定向进化等技术，Taq DNA聚合酶获得了许多催化性能改善或展现新功能的突变体，拓宽了酶的应用范围，下面就来做一个回顾。
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通过理性设计得到的突变体
①缺失突变体。Taq DNA聚合酶的第一个突变体就是N端删除大片段了，根据删除长度的差异，有不同的名称：KlenTaq(∆236)（Barnes, 1992），Klentaq1(∆280)（U.S. Patent 5436149），Stoffel(∆289)（Lawyer, 1993），它们本质上是一样的，都是5’-3’外切结构域缺失的突变体。N端删除Taq的耐热型、盐离子耐受能力、保真性都有所提高，但持续合成能力显著下降，对引物3’端错配的敏感性明显降低，这说明5’-3’外切结构域对酶的整体构象可能有很大的影响。研究人员发现大肠杆菌pol I后，又发现一种N端截短的Klenow片段，后者在DNA扩增上具有更好的表现，因此，研究人员得到Taq DNA聚合酶后，发现它与pol I有很多相似之处，自然而然的会进行这种尝试。根据结构或功能相似的酶对目标酶进行结构域编辑或者氨基酸替换，是一种常用的分子改造策略。
②Sanger测序突变体。使用Taq作为测序酶时发现，Taq无法掺入顺利ddNTP（除ddGTP），Tabor等（Tabor, 1995）通过F667Y突变体解决了这个问题。但是Taq(F667Y)掺入ddNTPs的速率不均匀，强烈偏向ddGTP，Li等（1999）在Klentaq1与ddNTP复合物晶体结构的基础上，对R660残基进行突变，结果R660D/F667Y双突变体掺入ddGTP与其它双脱氧核糖核苷酸的速率基本一致。根据酶-底物复合物的晶体结构对酶进行理性设计是一种常用的酶进化方式，当然也比较有难度，很多时候酶-底物的晶体甚至酶的晶体不易得，即使得到晶体结构，也很难判断关键的氨基酸。通常的做法是根据酶-底物的分子相互作用，扫描活性口袋的氨基酸，这种方法经常能在增强底物亲和力、拓宽底物谱方面得到满意的结果。 -
通过定向进化得到的突变体
定向进化是一种十分强大的酶分子改造技术，与理性设计的“所见即所得”不同，它的的特点是“所筛即所得”。定向进化允许构建庞大的突变体库，这就让酶有了各种可能（在自然界中这可能需要几百万年以上的时间），只要找到高效的筛选方法，一般都能得到令人惊喜的结果。构建突变体的方法有易错PCR、DNA改组、交错延伸PCR、体外随机延伸PCR等，筛选一般包括初筛与复筛，初筛依靠添加筛选压力让目标突变体留存下来，复筛将留存下来的克隆进行性能比较，从而选出最优秀的突变体。筛选的主要压力来自于初筛，必须具有高通量的方法，因为突变体库多样性可达108-109，一般采用与显色化学反应，酶促反应偶联产生便于观察的信号。
2001年，Ghadessy等报道了一种分区自我复制（Compartmentalized Self-replication，CSR）技术，该技术通过油水混合，形成一个个微小的油包水体系，每个体系就好像一个独立的隔离室，含有携带Taq DNA聚合酶突变体的大肠杆菌、dNTP、PCR buffer和Taq DNA聚合酶的引物，油包水体系在高温条件下仍具有很高的稳定性，通过预热变性，大肠杆菌释放出Taq DNA聚合酶，通过PCR循环，在筛选压力条件下，具有高活性的突变体以自身基因为模板进行PCR扩增，无义突变体被淘汰，反应结束纯化被富集的DNA产物，即得到了优秀的突变体基因。
（Ghadessy F J, 2001）CSR总体方案。 （1）在大肠杆菌中克隆并表达聚合酶基因，球形代表有活性的聚合酶分子。 （2）将含有聚合酶和编码基因的细菌细胞悬浮在含有引物和dNTP的反应缓冲液中，并分离到水室中。 （3）聚合酶从细胞中释放出来，进行自我复制。 活性低的聚合酶（白色六边形）无法复制其编码基因。释放后代聚合酶基因并重新克隆，以进行另一轮CSR。
Ghadessy等得到两个突变体：T8（F73S, R205K, K219E, M236T, E434D, A608V），在97.5°C下的半衰期提高11倍，但催化效率和保真性有所下降；H15（K225E, E388V, K540R, D578G, N583S, M747R），对高浓度肝素抑制剂抗性提高130倍以上，但耐热性显著下降，催化活性也有下降。虽然本次研究没有得到非常优秀的突变体，但CSR技术为热稳定DNA聚合酶的定向进化提供了高效筛选方法，这种方法远比结果更有意义。
③热启动突变体。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2003）以Klentaq为模板，通过易错PCR得到突变体库，然后利用一种基于放射性dNTP标记的在位筛选方法得到一个Klentaq Cs3AC（E626K，I707L）突变体，该突变体在37℃时活性明显降低，但68℃时仍保持正常活性，是一款极具潜力的热启动酶。2009年，该团队在Cs3AC的基础上对706-708残基进行饱和扫描突变，经过筛选得到一个突变体Klentaq 10（E626K， I707L，E708K），该突变体的全血抑制抗性、土壤抑制抗性、荧光染料抑制抗性比野生酶都有提高，研究人员将三个氨基酸替换平移到全长Taq DNA聚合酶上之后，得到一突变体Taq 22（E626K， I707L，E708Q）抑制剂抗性比野生Taq显著提高。Taq 22不但获取了冷敏感特征，提高了抑制剂抗性，还保持了野生Taq的热稳定性和催化活性，如果配合TP7抗体，具有“热启动”PCR试剂盒开发的潜力。
④逆转录活性突变体。野生型Taq DNA聚合酶没有逆转录活性，但Sauter等（Sauter, 2006）以KlenTaq为模板通过易错PCR和微孔板筛选，得到两个个逆转录活性提高的突变体：KlenTaq M1（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G），KlenTaq M2（L322M，L459M，S515R，I638F，S739G，E773G，L789F）。为了将这种增强的逆转录活性用于基于探针的一步法RT-qPCR检测，Kranaster等（Kranaster, 2010）将KlenTaq M1的突变平移到全长Taq上，得到一个新突变体Taq M1，结果Taq M1即基本保留了野生Taq酶的PCR性能，又显著增强了逆转录活性。Blatter等（Blatter, 2013）进一步将M1的突变与M747K（Gloeckner, 2007）混组，得到一个新突变体RT-KTq2（L459M，S515R，I638F，M747K），RT-KTq2的逆转录能力比KlenTaq M1更强，并且DNA模板扩增能力也有所提高。RT-KTq2的高耐热性有利于提高RT-PCR的特异性，RT-KTq2无RNase H活性，降低了RNA损伤，因为兼具DNA聚合酶活性，可以实现了逆转-扩增一酶化。Blatter等用RT-KTq2对几个人源基因进行的基于SYBR的RT-qPCR检测，得到了不错的扩增曲线，但作者没有与商品化MMLV/Taq逆转录试剂盒对比，如果RT-KTq2能达到或接近MMLV的逆转录活性，那么RT-KTq2能够成为一款优秀的逆转录扩增酶。
⑤抑制剂抗性突变体。从各种各样的样本中进行核酸检测，是PCR的一个重要应用领域。一般的流程是，先从样本中将核酸提取出来，再用DNA聚合酶进行PCR扩增，最后根据核酸电泳条带或者荧光信号等方式观察扩增结果。有时候，因为样本的稀有性等原因无法提取DNA，或者基于检测时效性和便利性的考虑，我们希望能够直接从样本中扩增靶标基因，比如血液、动植物组织、土壤。这些样本中的复杂组分可能对DNA聚合酶有很强的抑制作用，失败的扩增会造成假阴性的误判，这促使研究人员通过分子改造提高聚合酶的抑制剂耐受性。野生型Taq DNA聚合酶对血液、土壤等抑制剂的耐受性很差，N端删除大片段的耐受性有所提高，但仍然难以满足要求。Kermekchiev等（Kermekchiev, 2009）通过定点饱和扫描突变得到的Klentaq 10和Taq 22突变体，可以耐受25%的全血和15%的土壤提取物，E708残基可能发挥了重要作用。相比一般的定向进化手段，CSR技术为获得高抑制剂耐受性突变体提供了基础。Baar等（Baar, 2011）选择了与Taq DNa聚合酶序列同源性较高的八个物种的聚合酶为亲本，通过StEP技术获得8T嵌合体文库，以泥炭提取物、焦油、腐植酸等抑制剂为筛选压力，经过三轮CSR，得到了一个优秀突变体2D9。2D9是由四种不同的聚合酶混组的嵌合体，在多种抑制剂存在条件下，耐受性都有显著的提高，并且保真度与野生Taq基本一致。
（Baar C, 2011）不同抑制剂下2D9对野生型Taq的相对活力
2014年，该团队（Arezi, 2014; Hogrefe, 2016）通过CSR得到一个新的全长Taq突变体Taq 2C2（G59W，V155I，L245M，L375V，E507K，E734G，F749I），对EDTA血耐受比例达到65%，对肝素血耐受达到25%，催化速率也比野生酶有所提高，可以作为直接血液核酸检测试剂盒的聚合酶。2016年，Schafer等以Taq-E507K为亲本，通过定向进化得到一个突变体Taq 15（A61T, K346E, S357C, E507K, I707M, F749I），该突变体对PCR buffer中的缓冲液、盐离子浓度具有极高的耐受性，可以很好的直接从葡萄、马铃薯叶片中扩增>1Kb的DNA片段，可用于植物叶片直扩PCR试剂盒的研发。
⑥快速延伸突变体。Taq DNA聚合酶在72℃时延伸速率大约是60nt/s，但实际中一般以1kb/min的速率扩增，一般一个PCR扩增下来，需要1-2h的时间。对于大样本量的检测或者时间要求急迫的检测，人们希望能够更快的扩增。Taq 2C2突变体的催化效率大约是野生Taq的2倍，氨基酸突变E507K对这种增强作用有重要意义。在一些报道中，直接提高Taq DNA聚合酶Kcat的突变体不多，但一般增加了模板亲和力或容错能力的突变体，往往在较短时间内扩增长片段的能力也同样增强。
⑦长片段扩增突变体。Taq DNA聚合酶在长片段扩增上，最卓越的成果是Klentaq1与Pfu混合酶（Barnes, 1994; U.S. Patent 5436149），可以扩增长达35kb的Lambda DNA片段，保真性也比Taq DNA聚合酶显著提高，但单独的Klentaq1持续合成能力是显著下降的（比Taq低10倍）。Ignatov等（US 11/658,610）将Tth DNA polymerase（该酶的扩增能力高于Taq，但区分对引物3’错配不敏感）的N端4-600多肽与Taq DNA polymerase的C端554-832多肽拼接成一个新的嵌合体酶Tth-Taq，嵌合体的扩增能力接近Tth，延伸能力比Taq酶显著提高。将具有DNA结合能力的ssDNA或dsDNA结合蛋白与Taq DNA聚合酶融合，也能提高酶的延伸能力，但真正意义上的长延伸突变体，还是Yamagami等（Yamagami, 2014）通过对E742和A743的扫描突变得到的。E742A和A743H两个突变体能够很好的从Lambda DNA上扩增15kb的长片段（条件：99℃ 5 s，66℃ 5 min，30个循环）。然而有趣的是，E742A/A743H双突变体的引物延伸能力比单突变强得多，但PCR效果却不如单突变体。凝胶迁移实验的结果表明双突变体与DNA产物有更强的结合能力（在电泳图上产生拖带），这可能不利于PCR起始阶段的扩增，导致PCR失败。我在融合Sso7d结构域与KOD DNA聚合酶时，也发现了类似的情况。有研究人员认为，Taq DNA聚合酶校正活性的缺失限制了其长片段扩增能力，因为随着目标产物长度的增加，延伸过程出错配的概率也就越高，阻挡了继续延伸，保真酶因为能切除错配，往往具有更强的持续延伸能力。这个解释符合事实，我认为长片段延伸突变体除了提高Taq DNA聚合酶的DNA亲和力，也可能增加了“容错”能力，实际上是降低了保真性，这类突变体的实际应用意义不太大，高保真聚合酶在这方面明显具更有优势。
⑧RNA聚合活性突变体。对Taq DNA聚合酶底物谱的改变，是其分子改造的一个重要成果之一，除了前面介绍的增强Taq DNA聚合酶掺入ddNTP、dNTP标记物等非标准脱氧核糖核苷酸的突变体，还有些研究将Taq DNA聚合酶变成了Taq RNA聚合酶。Xia等（Xia, 2002）以Stoffel片段为模板，通过基于噬菌体展示的定向进化，将其RNA聚合活性提高103-104。
Ong等（Ong J L, 2006）通过一种称为short-patch CSR的定向进化方法，得到一个突变体AA40（E602V，A608V，I614M，E615G）能够以与wt酶掺入dNTPs相同的催化效率掺入NTPs和dNTPs。
⑨跨损伤扩增突变体。Taq DNA聚合酶的跨损伤突变体，大多是由使用CSR技术而闻名的Holliger实验室完成的。d'Abbadie等（d'Abbadie, 2007）以Taq、Tth、Tfl三种聚合酶为亲本，经StEP混组和三轮CSR筛选得到若干突变体，扩增47,000-60,000年前的洞熊DNA时，成功率比野生酶显著提高。Loakes等（Loakes, 2009）通过CSR得到一个突变体5D4，能过聚合疏水性碱基类似物，后来Millar等（2015）将5D4用于重亚硫酸盐测序，结果发现5D4能够很好的跨过DNA损伤。此外，Obeid等（Obeid, 2011）以KlenTaq为模板，通过定向进化得到两个突变体I614K和M747K，它们获得了增强的跨损伤扩增能力。Obeid等I614K和M747K组合在一起后，双突变体的跨损伤扩增能力修复能力比单突变体显著增强。不过，这些突变体跨损伤能力的增强，是以牺牲保真性或者正常DNA扩增效率为代价的，它们应用范围比较狭窄，商业化价值不是太大。 -
通过结构域融合得到的突变体
⑩结构域融合突变体。一些来源于嗜热菌的的α-螺旋结构具有稳定DNA的作用，Pavlov等（Pavlov, 2002）将DNA拓扑异构酶V上一段重复的螺旋-发夹-螺旋结构融合到Taq DNA聚合酶的N端和C端，结果N端融合酶TopoTaq对Na+、K+、甜菜碱的耐受能力显著提高，并且耐热性也有很显著的增强。Davidson等（Davidson, 2003）将Taq DNA聚合酶的480-485残基替换为T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域（TBD），结果融合体的合成能力提高了20-50倍，移码突变概率降低6-7倍。后来，Wang等（Wang, 2004）将来自Sulfolobus solfataricus的Sso7d双链DNA结合蛋白，融合在Taq和Stoffel片段的N端，结果发现S-Taq与S-Stoffel的持续合成能力比之前显著增强，融合蛋白与野生酶的Kcat基本一致，但Km比野生酶降低4-8倍，融合蛋白还增加了对盐离子的耐受性，令人兴奋的是融合蛋白还没有改变酶的耐热性和保真性。Sso7d的融合“红利”在家族B的Pfu DNA聚合酶上效果更明显，风靡市场的Phusion高保真聚合酶就是Pfu-sso7d。
（Wang Y, 2004）Taq，Stoffel和S-Stoffel的PCR效率比较。 以DNA（130 pg / ml）为模板，扩增子的大小显示在底部。 PCR程序为：95°C 20s； 94°C 5s，72°C 30s（A）或60s（B）或2min（C），20个循环； 72°C 7分钟。
结语
- CSR在Taq DNA聚合酶定向进化上的应用，改变了Taq DNA聚合酶及其他耐热型DNA聚合酶分子改造的面貌。虽然Baar等（2011）认为CSR继承性的选择聚合酶保真性，这是其自身的特征，因为这种“自我复制”必须在“错误阈值”内进行。他们应该是这个意思：如果CSR筛选到的聚合酶保真性显著下降，那么在CSR过程中就会引入随机突变，而这种随机突变可能改变原来的性质，比如降低了对筛选的压力的抗性，那么CSR就会无法进行下去，即“突变者，死”，因此CSR在聚合酶保真性上具有内在稳定性。但是，我认为这种解释有一定道理，但不能保证CSR的保真性，理由有两个：1. 除非保真性发生数量级程度的下降，一般程度的下降，可能对于2.5kb左右的模板，并不会产生大量随机突变；2. 即使发生稳定遗传的随机突变也可能不会显著影响针对筛选压力的性能。当然，我们也不能否认传统定向进化方法对Taq DNA聚合酶改造的贡献，这种方法需要大量挑选克隆子，然后进行活性分析，是一项十分繁重的工作。相比之下，理性设计或者基于已知位点的突变组合，针对性强的多，它需要以酶和酶-底物复合物的晶体结构为依据。对同源性较高的不同DNA聚合酶进行混组，是一种不错的体变体构建方式，尤其是选取功能互补的亲本。
-
Taq DNA聚合酶具有两种形式，全长和N端删除大片段（统称Klentaq）。研究认为5’-3’外切结构域耐热型不如聚合结构域，因此Klentaq的热稳定性高于全长酶，外切结构域具有DNA结合作用，能阻止聚合酶与模板的彻底解离，因此全长酶具有更强的持续合成能力。虽然5’-3’外切结构域在空间上似乎与聚合结构域相互分离，但根据前文列举的突变体，不难发现5’-3’外切结构域对全长酶的底物特异性也有很大影响，可能5’-3’外切结构域的离去改变了聚合结构域的构象。我从PDB数据库下载了全长酶与Klentaq的三维结构数据，通过结构拟合发现，全长酶与Klentaq的聚合酶结构域确实存在几个无法重叠的α螺旋。
全长Taq与KlenTaq的结构拟合。选取全长Taq的三维结构（PDB:1TAQ）和KlenTaq三维结构（PDB:4ELU），使用SPDBV执行Magic Fit。两处箭头代表全长片段与KlenTaq片段不重叠的二级结构，有多处不重叠，主要集中在拇指域和手指域，这两个区域是已知的底物特异性的关键区域，两者的差异正好说明了两者在底物特异性上的差异。
突变体序列汇总
| 名称 | 突变位点 | 特点 | 应用 |
|---|---|---|---|
| Taq-WT | - | 5'-3'外切，5'-3'聚合，耐热 | 热循环PCR |
| Klentaq | ∆236,∆280,∆289等 | 热抗性、盐抗性、保真性增强，延伸长度下降 | 热循环PCR |
| Thermo SequenaseTM | (∆272)F667Y | 掺入ddNTP能力增强 | Sanger测序 |
| Taq-FY&RD | R660D,F667Y | 掺入ddNTP均衡性增强 | Sanger测序 |
| Taq-T8 | F73S,R205K,K219E,M236T,E434D,A608V | 耐热性增强，催化活性下降 | - |
| Taq-H15 | K225E,E388V,K540R,D578G,N583S,M747R | 肝素耐受性显著增强，耐热型严重下降 | - |
| SF-SFR3 | (∆286)A597T,W604R,L605Q,I614T,E615G | 显著增强RNA合成活性 | (高温)RNA合成 |
| KlenTaq-CS3AC | (∆236)E626K,I707L | 冷敏感 | 热启动PCR |
| Taq/TBD(exo-) | ∆480-485/262-337(T3 DNA polymerase) | 延伸长度增加，移码突变率降低 | 重复序列PCR/LA-PCR |
| S-Klentaq | Sso7d-Taq(∆289) | 延伸长度增加，盐抗性增加 | (快速)PCR |
| S-Taq | Sso7d-Taq | 延伸长度增加，盐抗性增加，（可能不稳定） | LA-PCR |
| Klentaq-M1 | (∆289)L322M,L459M,S515R,I638F,S739G, E773G |
增强逆转录活性 | (高温)一步RT-qPCR |
| Taq-M1 | L322M,L459M,S515R,I638F,S739G,E773G | 增强逆转录活性 | (高温)一步RT-qPCR（探针法） |
| Taq-M1(2) | G84A,D144G,K314R,E520G,F598L,A608V, E742G |
扩宽底物谱，容错性增加 | LA-PCR |
| Taq-3A10 | (Tth-Taq嵌合体)L33P,E76K,D145G,P552S, E775G,M777T |
跨损伤扩增 | 古代DNA扩增 |
| Taq-5D4 | (Tth-Taq嵌合体)V62I,Y78H,T88S,P114Q, P264S,E303V,G389V,E424G,E432G,E602G, A608V,I614M,M761T,M775T |
拓宽底物谱 | BS-seq |
| Taq-197 | V618I,L619M,V631A,I638V,T640K,M646V, M658L,A661I,T664A,I665V, L670M,F700Y,T756S,A757G |
掺入可逆性标记dNTP能力显著增强 | NGS测序 |
| Taq-D2 | E9K,S50N,E209K,E507K | 延伸长度增加，盐抗性增加 | 热循环PCR |
| Klentaq-10 | (∆280)E626K,I707L,E708K | 冷敏感，抑制剂耐受增强 | “热启动”qPCR(SYBR) |
| Taq-22 | E626K,I707L,E708Q | 冷敏感，抑制剂耐受增强 | “热启动”qPCR(探针) |
| Taq-2D9 | Tth,Tos,Tbr,Taq嵌合体 | 广泛的抑制剂抗性 | 直扩PCR |
| Taq-2C2 | G59W,V155I,L245M,L375V,E507K,E734G, F749I |
血液耐受增强，延伸速率增加 | (血液)直扩PCR |
| Taq-AA | E742A | 延伸长度增加 | LA-PCR |
| Taq-EH | A743H | 延伸长度增加 | LA-PCR |
| Taq-15 | A61T,K346E,S357C,E507K,I707M,F749I | 植物叶片抑制剂耐受增强，盐离子耐受增强 | (植物)直扩PCR |
参考文献
[1] Brock T D, Freeze H. Thermus aquaticus gen. n. and sp. n., a nonsporulating extreme thermophile[J]. Journal of bacteriology, 1969, 98(1): 289-297.
从黄石国家公园的各种温泉和加利福尼亚的温泉中分离出一种水生栖热菌，命名为Thermus aquaticus YT-1，该细菌是专性需氧菌，其最适pH为7.5至7.8。生长的最佳温度为70°C，最高为79°C，最低为40°C。
[2] Chien A, Edgar D B, Trela J M. Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus[J]. Journal of bacteriology, 1976, 127(3): 1550-1557.
介绍了一种从Thermus aquaticus分离出的DNA聚合酶，这种酶的最适温度为80℃，需要dNTP和镁离子，最适pH为8.0，分子量63KD-68KD。
[3] Sanger, F., Nicklen, S., and Coulson, A. R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463–5467.
介绍了Sanger测序的原理、方法和应用。
[4] Mullis K, Faloona F, Scharf S, et al. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction[C]//Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986, 51: 263-273.
介绍了在体外利用大肠杆菌pol I Klenow片段进行DNA扩增的方法。
[5] Tabor S, Richardson C C. DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1987, 84(14): 4767-4771.
介绍了利用T7噬菌体DNA聚合酶突变体进行DNA测序的效果，突变体的3’-5’外切活性的仅剩野生酶的0.01%，测序读长和均匀性显著改善。
[6] Tindall K R, Kunkel T A. Fidelity of DNA synthesis by the Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biochemistry, 1988, 27(16): 6008-6013.
介绍了基于lacZa的蓝/白色斑测定DNA聚合酶保真性的方法，测定了AMV Pol、Pol I(KF)和Taq的保真性。
[7] Saiki R K, Gelfand D H, Stoffel S, et al. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase[J]. Science, 1988, 239(4839): 487-491.
介绍了利用从Thermus aquaticus中分离的一种耐热型DNA聚合酶，进行体外DNA扩增的方法及效果。
[8] Innis M A, Myambo K B, Gelfand D H, et al. DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1988, 85(24): 9436-9440.
介绍了Taq DNA聚合酶在PCR产物测序中的表现。
[9] Clark J M. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases[J]. Nucleic acids research, 1988, 16(20): 9677-9686.
介绍了一些真核和原核来源（包括Taq DNA聚合酶）的DNA聚合酶，在无模板指导情况下，将脱氧核糖核苷酸添加到平端DNA底物的3'羟基末端的特征。
[10] Lawyer F C, Stoffel S, Saiki R K, et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus[J]. Journal of Biological Chemistry, 1989, 264(11): 6427-6437.
介绍了Taq DNA聚合酶的克隆、大肠杆菌表达及酶学特征研究。
[11] D'Aquila R T, Bechtel L J, Videler J A, et al. Maximizing sensitivity and specificity of PCR by pre-amplification heating[J]. Nucleic Acids Research, 1991, 19(13): 3749.
介绍了一种提高PCR产量和特异性的方法：将模板与PCR试剂预先加热到高于退火温度的温度，在热块上混合后再进行PCR。
[12] Holland P M, Abramson R D, Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'-3'exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1991, 88(16): 7276-7280.
介绍了利用Taq DNA聚合酶5’-3’外切活性切除放射性标记探针5’端碱基，通过放射性信号变化检测DNA的方法，促进了探针法qPCR技术的发展。
[13] Barnes W M. The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion[J]. Gene, 1992, 112(1): 29-35.
介绍了一个N端236aa缺失的Taq DNA聚合酶突变体KlenTaq，其保真性高于全长酶。
[14]Huang M M, Arnheim N, Goodman M F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR[J]. Nucleic acids research, 1992, 20(17): 4567-4573.
介绍了基于Taq DNA聚合酶检测SNP的原理：如果引物3’末端与模板不匹配，Taq DNA聚合酶扩增效率很低甚至无法扩增靶标基因。
[15] Lawyer F C, Stoffel S, Saiki R K, et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5'to 3'exonuclease activity[J]. Genome research, 1993, 2(4): 275-287.
介绍了Taq全长和N端删除片段∆289-Taq（Stoffel片段）的克隆表达及酶学性质研究，结果∆289-Taq的热稳定性、盐离子耐受性高于全长酶，但持续合成降低10倍。
[16] Hu G. DNA Polymerase-catalyzed addition of nontemplated extra nucleotides to the 3′ of a DNA fragment[J]. DNA and cell biology, 1993, 12(8): 763-770.
介绍8种来源于噬菌体、大肠杆菌、栖热菌、火球菌等生物的DNA聚合酶，无模板3'延伸的特点，指出末端延伸的碱基具有一定偏好性，与末端碱基种类有关。
[17] Sharkey D J, Scalice E R, Christy K G, et al. Antibodies as thermolabile switches: high temperature triggering for the polymerase chain reaction[J]. Bio/Technology, 1994, 12(5): 506-509.
介绍了几种高亲和力的抗Taq DNA聚合酶单克隆抗体，37℃时能完全抑制Taq的活性，高温变性后又能够完全释放出Taq的活性。
[18] Scalice E R, Sharkey D J, Daiss J L. Monoclonal antibodies prepared against the DNA polymerase from Thermus aquaticus are potent inhibitors of enzyme activity[J]. Journal of immunological methods, 1994, 172(2): 147-163.
介绍了九种不同的针对Taq DNA聚合酶重组体的单克隆抗体与Taq的免疫学作用。
[19] Barnes W M. PCR amplification of up to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1994, 91(6): 2216-2220.
介绍了通过混合Klentaq1与低浓度的Pfu能够显著提高PCR延伸长度的现象。
[20] Barnes W M. Thermostable DNA polymerase with enhanced thermostability and enhanced length and efficiency of primer extension: U.S. Patent 5436149[P]. 1995-7-25.
介绍了一个N端缺失突变体Klentaq1与Pfu混合后PCR性能显著改善的现象。
[21] Merkens L S, Bryan S K, Moses R E. Inactivation of the 5′-3′ exonuclease of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Structure and Expression, 1995, 1264(2): 243-248.
介绍了两个Taq DNA聚合酶全长酶突变体，通过对N端结构域氨基酸的替换，丧失了5'-3'外切活性，但它们的持续合成能力接近野生Taq酶，显著高于Klentaq。
[22] Kim Y, Eom S H, Wang J, et al. Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Nature, 1995, 376(6541): 612.
介绍了Taq DNA聚合酶全长酶的晶体结构。
[23] Tabor S, Richardson C C. A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy-and dideoxyribonucleotides[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(14): 6339-6343.
介绍了一个关键氨基酸的突变，显著提高了pol I和Taq掺入ddNTP的能力，这个碱基是pol I:F762、Taq:F667，对应位置T7 DNA聚合酶上的Y526。
[24] Reeve, M. A., & Fuller, C. W. A novel thermostable polymerase for DNA sequencing. Nature, 1995, 376(6543): 796–797.
介绍了F667Y突变显著提高了Taq DNA聚合酶（KF）的ddNTP掺入活性。
[25] Eom S H, Wang J, Steitz T A. Structure of Taq polymerase with DNA at the polymerase active site[J]. Nature, 1996, 382(6588): 278-281.
介绍了Taq DNA聚合酶与引物-模板复合物的晶体结构，比较了Taq KF与pol I KF的结构差异。
[26] Magnuson V L, Ally D S, Nylund S J, et al. Substrate nucleotide-determined non-templated addition of adenine by Taq DNA polymerase: implications for PCR-based genotyping and cloning[J]. BioTechniques, 1996, 21(4): 700-709.
介绍了Taq DNA聚合酶无模板3'延伸的概率与反向引物5’端碱基的种类有关，还与PCR程序有关。研究指出，在使用Taq DNA聚合酶进行等位基因分型和TA克隆时，根据3'端延伸特征调整引物设计是有利的。
[27] Cline J, Braman J C, Hogrefe H H. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases[J]. Nucleic acids research, 1996, 24(18): 3546-3551.
介绍了Taq、Pfu、Vent等一些耐热型DNA聚合酶的保真性。
[28] Vander Horn P B, Davis M C, Cunniff J J, et al. Thermo Sequenase™ DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing[J]. BioTechniques, 1997, 22(4): 758-765.
介绍了嗜酸嗜热菌无机焦磷酸酶（TAP）与Klentaq(F667Y)配合，可以产生均匀条带强度的序列数据，从而可以进行更长、更准确的序列测定。
[29] Li Y, Korolev S, Waksman G. Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation[J]. The EMBO journal, 1998, 17(24): 7514-7525.
介绍了Klentaq1-DNA模板-ddNTP三元复合物的晶体结构。
[30] Li Y, Mitaxov V, Waksman G. Structure-based design of Taq DNA polymerases with improved properties of dideoxynucleotide incorporation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1999, 96(17): 9491-9496.
介绍了一个Klentaq1突变体R660D/F667Y，该突变体即显著增强了掺入ddNTP的活性，又增加了掺入ddNTP的均一性。
[31] Ghadessy F J, Ong J L, Holliger P. Directed evolution of polymerase function by compartmentalized self-replication[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2001, 98(8): 4552-4557.
介绍了CSR技术在DNA聚合酶定向进化中的应用，作者通过CSR筛选得到两个Taq DNA聚合酶突变体T8（热稳性明显提高）和H15（肝素耐受性提高130倍以上）。CSR技术改变了热稳定DNA聚合酶的定向进化方式，意义重大。
[32] Ahmadian A, Gharizadeh B, O’Meara D, et al. Genotyping by apyrase-mediated allele-specific extension[J]. Nucleic acids research, 2001, 29(24): e121-e121.
介绍了通过腺苷三磷酸酶提高等位基因特异性延伸准确性的方法，3'端匹配时DNA合成速率快，可以正常掺入核苷酸，3'端错配时DNA合成缓慢，来不及延伸即被腺苷三磷酸酶降解。
[33] Pavlov A R, Belova G I, Kozyavkin S A, et al. Helix–hairpin–helix motifs confer salt resistance and processivity on chimeric DNA polymerases[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(21): 13510-13515.
介绍了HhH模体与Taq DNA聚合酶形成融合蛋白的性质，提高了热稳定性和盐离子耐受性。
[34]Xia G, Chen L, Sera T, et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2002, 99(10): 6597-6602.
介绍了一个RNA聚合活性显著增强的Taq DNA聚合酶的突变体。
[35] Davidson J F, Fox R, Harris D D, et al. Insertion of the T3 DNA polymerase thioredoxin binding domain enhances the processivity and fidelity of Taq DNA polymerase[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(16): 4702-4709.
介绍了一个将来源于T3 DNA聚合酶的硫氧还蛋白结合域插入Taq DNA聚合酶3’-5’外切结构域的突变体，显著提高了Taq酶的延伸能力并将降低了对DNA重复单元的移码突变率。
[36] Wang Y, Prosen D E, Mei L, et al. A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivity and improved performance in vitro[J]. Nucleic acids research, 2004, 32(3): 1197-1207.
介绍了将一个双链DNA结合蛋白(sso7d)与DNA聚合酶融合后，显著改善酶延伸能力的现象。本文分别将sso7d融合在Taq DNA聚合酶(∆289)和Pfu DNA聚合酶的N端和C端，不但显著增强了酶的持续合成能力，还不影响聚合酶的保真性等催化性能。Pfu-S7后来被广泛应用于高保真PCR，它就是现在大名鼎鼎的Phusion DNA聚合酶。
[37] Kermekchiev M B, Tzekov A, Barnes W M. Cold-sensitive mutants of Taq DNA polymerase provide a hot start for PCR[J]. Nucleic acids research, 2003, 31(21): 6139-6147.
介绍了一个Klentaq的冷敏感突变体Cs3AC，该突变体低温（37℃）时几乎没有聚合活性，高温（68℃）时保持正常聚合活性，可以实现DNA的热启动可扩增。
[38] Germer S, Higuchi R. Homogeneous allele-specific PCR in SNP genotyping[M]//Single Nucleotide Polymorphisms. Springer, Totowa, NJ, 2003: 197-214.
介绍了SNP检测的实时监测改进：将位点特异性PCR与（SYBR green I）qPCR结合。
[39] Sauter, K. B. M., Marx, A., Evolving thermostable reverse transcriptase activity in a DNA polymerase scaffold. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 7633–7635.
介绍了一个具有RNA聚合酶活性的Klentaq突变体M1，可用于一步法RT-qPCR检测。
[40] Ong J L, Loakes D, Jaroslawski S, et al. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide[J]. Journal of molecular biology, 2006, 361(3): 537-550.
介绍了一个改变了底物谱的Taq DNA聚合酶突变体，该突变体能够以基本相同的催化效率掺入dNTP个NTP，是一个耐热DNA/RNA合成双活性聚合酶。
[41] Gloeckner C, Sauter K B M, Marx A. Evolving a thermostable DNA polymerase that amplifies from highly damaged templates[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2007, 46(17): 3115-3117.
介绍了一个KlenTaq突变体M747K，M747K增加了dNTP错误掺入和错配延伸的可能性。
[42] d'Abbadie M, Hofreiter M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for amplification of ancient DNA[J]. Nature biotechnology, 2007, 25(8): 939-943.
介绍了一个能绕过DNA损伤和引物3’错配错配的一组突变体，并将突变体混合酶用于古代DNA的扩增，成功率显著提高。
[43] Loakes D, Gallego J, Pinheiro V B, et al. Evolving a polymerase for hydrophobic base analogues[J]. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131(41): 14827-14837.
介绍了一个能够掺入疏水性碱基类似物的突变体5D4，通过CSR改变了Taq DNA聚合酶的底物谱。
[44] Kermekchiev M B, Kirilova L I, Vail E E, et al. Mutants of Taq DNA polymerase resistant to PCR inhibitors allow DNA amplification from whole blood and crude soil samples[J]. Nucleic acids research, 2009, 37(5): e40-e40.
介绍了一个新的热启动Taq DNA聚合酶突变体Klentaq 10，除保持了冷敏感的特征外，还显著提高了荧光染料等抑制剂抗性，可用于热启动qPCR扩增。
[45] Gaudet M, Fara A G, Beritognolo I, et al. Allele-specific PCR in SNP genotyping[M]//Single Nucleotide Polymorphisms. Humana Press, Totowa, NJ, 2009: 415-424.
介绍了SNP检测中基于多位点扩增的单管反应法：使用两条上游引物（分别对应两种基因型）和一条下游引物，其中一条上游引物5’端加一段“尾巴”，并在等位基因第-1位设置一个额外的错配，这样3’末端不匹配的引物几乎完全不延伸，最后根据电泳条带的数目与位置即可准确判定基因型。
[46] Ignatov K, Kramarov V, Billingham S. Chimeric DNA polymerase: U.S. Patent Application 11/658,610[P]. 2009-8-20.
介绍了一个Tth DNA polymerase与Taq DNA polymerase的嵌合体酶，嵌合体集合了Tth与Taq的双重优势，延伸能力显著增强。这种嵌合体的方式也是酶分子改造的一种重要手段，不过它有一个前提，嵌合的亲本之间必须有较高的序列同源性。
[47] Guo J, Yu L, Turro N J, et al. An integrated system for DNA sequencing by synthesis using novel nucleotide analogues[J]. Accounts of chemical research, 2010, 43(4): 551-563.
介绍了基于3'端核苷酸可逆终止子（NRT）和可裂解的荧光双脱氧核苷酸（ddNTP）的DNA合成测序（SBS）用于第二代DNA测序的原理及潜力，为NGS高通量测序系统开发提供了参考。
[48] Leconte A M, Patel M P, Sass L E, et al. Directed Evolution of DNA Polymerases for Next-Generation Sequencing[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2010, 49(34): 5921-5924.
介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体Taq197，显著增加了可逆性修饰dNTP的掺入活性，具有NGS测序酶应用潜力。
[49] Chen F, Gaucher E A, Leal N A, et al. Reconstructed evolutionary adaptive paths give polymerases accepting reversible terminators for sequencing and SNP detection[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2010, 107(5): 1948-1953.
介绍了两个Taq DNA聚合酶突变体，掺入dNTP-ONH2底物的活性显著增强，还能同时掺入ddNTP，其中L616A对底物谱变化具有重要影响。
[50] Kranaster R, Drum M, Engel N, et al. One-step RNA pathogen detection with reverse transcriptase activity of a mutated thermostable Thermus aquaticus DNA polymerase[J]. Biotechnology journal, 2010, 5(2): 224-231.
介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体Taq M1，它具有与野生型酶相似的PCR敏感性和5’-3’核酸酶活性，同时也表现出逆转录酶的能力，可用于一步法RT-qPCR检测。
[51] Baar C, d’Abbadie M, Vaisman A, et al. Molecular breeding of polymerases for resistance to environmental inhibitors[J]. Nucleic acids research, 2011, 39(8): e51-e51.
介绍了一个通过CSR技术得到的抑制剂抗性Taq DNA聚合酶突变体2D9，将同源性较高的8种不同的聚合酶进行混组，通过CSR筛选得到2D9突变体，对腐植酸、土壤提取物、焦油等抑制剂均有较强的耐受性，可用于直扩PCR。
[52] Obeid S, Schnur A, Gloeckner C, et al. Learning from directed evolution: Thermus aquaticus DNA polymerase mutants with translesion synthesis activity[J]. ChemBioChem, 2011, 12(10): 1574-1580.
介绍了一个KlenTaq组合突变体，用于损伤性DNA检测的性能。作者将通过定向进化得到两个突变体I614K和M747K组合到一起，结果双重突变体在扩增有损伤的DNA时，扩增能力比单突变体显著提高。
[53] Blatter N, Bergen K, Nolte O, et al. Structure and Function of an RNA‐Reading Thermostable DNA Polymerase[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2013, 52(45): 11935-11939.
介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体RT-KTq2，它是在Taq M1基础上进一步突变得到的，逆转录活性更高，qPCR灵敏性更高，在RNA病毒一步RT-qPCR检测中具有不错的效果。
[54] Chen C Y. DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 305.
介绍了聚合酶的改造及发展对NGS技术的推动。
[55] Arezi B, McKinney N, Hansen C, et al. Compartmentalized self-replication under fast PCR cycling conditions yields Taq DNA polymerase mutants with increased DNA-binding affinity and blood resistance[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 408.
介绍了几个对全血耐受性极强的突变体，它们的催化速率比野生酶有所提高，表观解离常数降低35-90倍。研究还发现E507K能显著提高Taq在95℃下的半衰期
[56] Yamagami T, Ishino S, Kawarabayasi Y, et al. Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation ability as a useful reagent for genetic engineering[J]. Frontiers in microbiology, 2014, 5: 461.
介绍了通过对两个氨基酸的替换能够显著提高Taq DNA聚合酶PCR延伸长度的研究。
[57] Millar D, Christova Y, Holliger P. A polymerase engineered for bisulfite sequencing[J]. Nucleic acids research, 2015, 43(22): e155-e155.
介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体5D4，5D4是一种Taq DNA聚合酶和Tth DNA聚合酶的嵌合体，能够绕过重亚硫酸盐处理DNA的dU碱基和未转化完全的中间体dhU6S，研究人员使用5D4/Taq混合酶扩增BS处理后的人基因DNA片段，扩增效果显著优于Taq DNA聚合酶。虽然5D4/Taq的保真性比野生Taq有所下降，但在测序深度的修正下，不影基因甲基化位点分析的准确性。
[58] Schafer W, McEwan P, Van Der Walt E, et al. Modified DNA polymerases for improved amplification: U.S. Patent 9,315,787[P]. 2016-4-19.
介绍了一个Taq DNA聚合酶突变体Taq 15，对高浓度缓冲液和盐离子的耐受性显著增强，用于植物叶片的直接扩增表现良好。
[59] Hogrefe H, Cayouette M, Fox J, et al. Thermostable type-A DNA polymerase mutants with increased polymerization rate and resistance to inhibitors: U.S. Patent 9,523,085[P]. 2016-12-20.
介绍了Taq 2C2突变体应用在qPCR中，在缩短延伸时间和全血抑制抗性方面的表现。
[60] Bourn W, Appel M, Rush G, et al. Modified type A DNA polymerases: U.S. Patent 10,457,968[P]. 2019-10-29.
KAPA公司的专利，介绍一些定向进化得到的Taq DNA聚合酶突变体，文中列举的突变体比较多，其中Taq D2在DNA结合能力、高盐离子（K+、Na+）浓度抗性、PCR延伸长度、苯酚抗性方面比野生Taq具有更好的表现。
