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【文献分享】植物22-nt siRNAs介导了翻译抑制和胁迫适应

2022-04-06  本文已影响0人  巩翔宇Ibrahimovic

写在前面
本次分享一篇拟南芥表观遗传领域具有重要意义的paper,"Plant 22-nt siRNAs mediate translational repression and stress adaptation",通讯作者是南方科大郭红卫老师,题目即为文章主要结论,非常简洁,也是我比较欣赏的文章类型。之前表观遗传方面的文章接触的少,如有班门弄斧的地方还请指正。

Abstract

植物会产生长度分别为21,22,24nt的siRNAs,其中21nt的siRNAs负责mRNA的切割,24nt的siRNAs负责DNA甲基化,而22nt的siRNAs目前功能未知。作者鉴定到22nt siRNAs受DCL2(Dicer Like 2)的调控产生,当胞质RNA破坏并且DCL4缺乏时,大量的22nt的siRNAs产生,造成了许多生长缺陷,如极度矮化,分生组织缺陷和色素沉着。两个编码硝酸盐还原酶的基因-NIA1或NIA2-产生了几乎一半的22nt的siRNAs。22nt的siRNAs的产生使得大量基因沉默,诱导了特异性或整体的翻译抑制。此外,22nt的siRNAs在受到环境压力时偏好性积累,特别是那些来自NIA1或NIA2的siRNAs,22nt的siRNAs在翻译抑制、抑制植物生长和增强防卫反应方面发挥作用。

Introduction

双链siRNAs的前体由RDRP(RNA-dependent RNA polymerases)产生,miRNA前体被Dicer家族切割成20-24nt的sRNA。sRNA的一条链被装进AGO蛋白,形成RISC(RNA-induced silencing complex)来发挥功能。拟南芥包含4类Dicer蛋白,DCL1是主要的DCL蛋白,负责miRNA的合成,miRNA靶向同源RNAs行使切割或翻译抑制的功能;DCL3将双链RNA前体切割为24nt的siRNAs,24nt的siRNAs涉及到DNA甲基化过程;DCL4负责产生21nt的siRNA,介导mRNA切割;DCL2被认为是调控病毒21nt siRNAs的产生。

Results

1.Massive production of 22-nt siRNAs

拟南芥中,EIN5/XRN4(ETHYLENE INSENSITIVE5/EXORIBONUCLE-ASE4)和SKI2(SUPER KILLER2)通过抑制siRNAs的积累来阻止基因的沉默。【所以这两种突变体中,siRNAs极度活跃】我们发现 ein5 dcl4 和 ski2 dcl4 双突中,出现了多种生长缺陷:分生组织,叶片扩展,色素沉着(F1 a,b)。而 ein5 dcl2和ski2 dcl2双突变体中生长正常。有意思的是,dcl2和rdr6(转录后基因沉默突变体)恢复了ein5 dcl4 和 ski2 dcl4 双突体的表型(F1 a,b),这也就说明生长缺陷是由依赖DCL2和RDR6的22-nt siRNA产生所造成的。
通过实施sRNA测序,我们在ein5 dcl4 和ski2 dcl4突变体的TRANS-ACTING SiRNA (TAS) and non-TAS中,鉴定到丰富的 22nt siRNA,而非 21nt siRNA(F1 c)。在ein5 dcl4 和ski2 dcl4突变体中,我们分别鉴定到1182和182个基因产生22nt siRNA,其中111个基因是共有的。在这些基因中,我们注意到两个硝酸盐还原酶,NIA1 and NIA2,分别在ein5 dcl4 和ski2 dcl4突变体中贡献了总22nt siRNA的45%和48%。


F1 Disruption of cytoplasmic RNA decay and DCL4 triggers massive production of 22-nt siRNAs and cause growth disorders.png

2. 22-nt siRNAs repress mRNA translation

转录组测序发现只有极少的产生22nt siRNA的基因在ein5 dcl4(ed)ski2 dcl4(sd)突变体中表达量下降(F2 a,b),包括SMXL4和SMXL5。NIA1 and NIA2在突变体中展示出更高或没有改变的表达水平(F2c),NIA1 and NIA2在突变体中的蛋白水平表达量很低,即使添加MG132抑制了26S蛋白酶体降解途径也很难检测到,这就说明这两个蛋白的降解不依赖蛋白酶体途径(F2d)。同时,来自NIA1/2和GTE2/7(也产生22nt的siRNAs,GLOBAL TRANSCRIPTION FACTOR GROUP E2/7)多核糖体的mRNA的量(fractions 8-11)在ein5 dcl4双突变体中呈现出最低的水平{比较对象为 ein5 dcl4,WT,ein5 dcl4 dcl2} ,说明NIA1/2和GTE2/7的mRNA被22nt siRNAs所抑制(F2 ef)。总的核糖体RNA(fractions 6-11)在ed和sd水平也是减少的,并且能被dcl2突变所恢复,揭示了22nt的siRNAs具有全局的翻译抑制作用(F2f)。这也就说明 22nt siRNA,而不是21nt siRNA 抑制了其相应mRNA的翻译,整体水平也是一样。

F2 22nt-siRNAs repress mRNA translation.png

3. AGO1 is required for 22-nt siRNA activity

当ago1-27{该突变体AGO还能行使dicer的作用,但是翻译是抑制的}分别和ein5 dcl4、ski2 dcl4杂交后,生长的表型被恢复,NIA1/2的蛋白水平也被恢复(F3ab)。HUA ENHANCER 1 (HEN1)参与sRNA的甲基化,hen1部分恢复了ein5 dcl4、ski2 dcl4的表型,说明甲基化的22nt siRNA是发挥作用的。
为了探明AGO1对22-nt siRNA的活性是否重要,我们将AGO1免疫沉淀下来,再进行sRNA测序。与AGO1联系的21nt 和22nt siRNA具有5‘尿嘧啶的偏好性,这与之前的报道是一致的。与AGO1相关的22nt siRNAs的丰度与ein5 dcl4中的siRNAs的丰度呈现正相关。并且来自NIA1/2的大量22nt siRNAs也与AGO1有关(F3c),这也就说明带有5’尿嘧啶 22nt siRNAs能够被选择性地装入AGO1。
使用体外地cell-free系统验证22nt siRNAs的抑制作用。当将NIA2的mRNA和RISC孵育的时候,21nt siRNAs展示出比22nt siRNAs 更快的切割(F3 de),可能是因为AGO1装载21nt siRNAs的效率更高。同时22nt和21nt siRNAs导致了NIA2蛋白水平的减少(F3 df)。通过计算NIA2蛋白水平到转录水平的比率,我们发现22nt siRNAs抑制NIA2蛋白水平减少的效率比21nt siRNAs要高(F3g),这也就支持了潜在的翻译抑制机制。
22nt siRNAs 在ein5 dcl4和ski2 dcl4是多的,再突变AGO1以后,22nt siRNAs就变少(F3 h-j)。这些结果就说明AGO1的功能,特别是它抑制翻译的功能,与更有效的22nt siRNAs的合成有关。


F3 22nt siRNAs mediate translational repression and siRNA amplification in an AGO1-dependent manner.png

4.22-nt siRNAs in stress adaptation

ski2 dcl4突变体展示出明显的根生长抑制,这与nia1/2双突的表型很像(F4 ab),再突变dcl2后,表型又恢复(F4a)。GO富集分析发现在突变体中 stress相关的通路被激活,生长响应的通路被抑制,这也就说明22nt siRNAs精细的调控植物地生长和压力响应。
在培养基中缺乏氮地情况下,WT中有更多的22nt siRNAs被诱导产生,这在dcl4中更明显(F4 c),包括来自NIA1/2的siRNAs(F4 d)。一个可能的解释是DCL2的诱导下调了SKI2、EIN5和DCL4的表达(F4f)。缺乏N以后导致几乎没有NIA1/2蛋白积累,并且RNA水平也是减少的(F4 gh)【这里比较迷,因为NIA1/2的表达是受N诱导的,缺氮一方面表达少,另一方面是22nt siRNAs的作用】。因此我们假设,缺氮条件下,NIA1/2的表达也减少,RNA decoy和DCL4的活性降低造成了22nt siRNAs的增加,22nt siRNAs抑制NIA1/2的翻译过程。supplement上说ABA处理和高盐处理也能增加22nt siRNAs的产生,这也就说明,22nt siRNAs的产生,特别是来自NIA1/2的,对于植物适应环境压力是有必要的。

F4 Functional analysis and environment unduction of 22-nt siRNAs.png

模型解读:
在受到环境胁迫时,如氮饥饿,通过RNA损伤和抑制DCL4的活动,22nt siRNAs得到积累,进一步造成翻译抑制并激活sRNA的扩增。

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