Circular RNA CDR1as disrupts the

本文选自套路是怎样练成的，喜欢的可以联系我。

摘要：背景：抑癌基因p53的失活在胶质瘤，特别是多形性胶质母细胞瘤(GBM)的发病机制中起着至关重要的作用。MDM2是p53的主要负性调控因子，它与p53结合并与其形成稳定的复合物，调节其活性。到目前为止，p53/MDM2复合体的稳定性是否受到lncRNAs的影响尚不清楚，尤其是通常丰富和保守的环状RNA，它们经常与不同的肿瘤发生过程有关。方法：采用RIP-seq和RIP-qPCR方法检测p53结合的最丰富的lncRNAs(包括环状RNA)，然后用生物信息学分析其表达与p53信号转导和胶质瘤发生的相关性。随后，分别用RNA FISH和RT-qPCR方法检测CDR1as在325例中国人脑胶质瘤患者中的表达情况，评价CDR1as在中国最大的脑胶质瘤患者队列中的临床意义，并对CDR1as基因在人脑胶质瘤组织中的表达进行分析。RNA FISH和蛋白免疫荧光结合检测CDR1as和P53的共定位，Chirp实验证实RNA与蛋白质的相互作用。免疫印迹法检测CDR1as表达受控细胞的蛋白表达、P53/MDM2相互作用和P53泛素化情况。通过免疫印迹、RT-qPCR和荧光素酶报告实验检测CDR1as对p53表达、稳定性和活性的影响。同时，用流式细胞仪和免疫组织化学方法检测CDR1as对DNA损伤的影响。成瘤性实验检测CDR1as对裸鼠GBM细胞移植瘤克隆形成、细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响(体外)，对裸鼠移植瘤体积/重量和存活的影响(体内)。

结果：CDR1as与p53蛋白结合。CDR1as的表达随着胶质瘤分级的增加而降低，是胶质瘤尤其是GBM患者总体生存的可靠独立预测因子。CDR1as通过一种独立于miRNA海绵的机制，通过阻止P53蛋白泛素化来稳定它。CDR1as直接与MDM2结合所必需的p53 DBD结构域相互作用，从而破坏p53/MDM2复合物的形成。在DNA损伤诱导下，CDR1as可以保护p53功能，保护细胞免受DNA损伤。值得注意的是，CDR1as在体外和体内都能抑制肿瘤生长，但对p53缺失或突变的细胞影响很小。结论：CDR1as不是作为miRNA海绵，而是通过直接与其DBD区域的p53结合来限制MDM2的相互作用而发挥肿瘤抑制作用。因此，CDR1as结合破坏p53/MDM2复合物，防止p53泛素化和降解。CDR1as还可以感知DNA损伤信号，并可能通过与P53形成复合体来保护p53的功能。因此，CDR1as缺失可能通过下调P53在胶质瘤中的表达而起到促进肿瘤发生的作用。我们的结果进一步加深了我们对环状RNA，特别是CDR1的作用和作用机制的理解，并有可能为胶质瘤的有效治疗开辟新的治疗途径。

这种套路，闭着眼都能看出他们玩了什么玩意儿，无非就是IP和FISH。结果一堆，有用者寥寥。临床大夫的科研就是以欺骗别人开始到欺骗自己结束。

首先是怎么找到的CDR1as，通过找能与P53结合的lncRNA，做了RIP,然后做PCR验证一波，在验证这些与P53途径激活的相关性，发现了这个circ，那最多的为什么不去研究，通过TCGA数据库进一步分析了这个基因的临床病例意义，发现在分期和生存上有意义。

用P53拉一拉这个基因，然后做做共位，发现有共位，可以被P53拉下

紧接着，在细胞水平，做了circ与P53蛋白的关系，在蛋白水平提高了P53以及下游靶点的表达水平，但是，并没有改变mRNA水平，P53可以被Nutlin3挽救（MDM2抑制剂），CDR1 AS过表达后p53转录活性增加，而CDR1 AS下调后转录活性降低

然后用蛋白质合成抑制剂CHX处理过表达细胞，发现明显抑制的P53的蛋白合成，可能归咎于蛋白质被迅速降解了，蛋白质降解主要是通过泛素化，并且MDM是泛素化的酶，所以作何用做P53泛素化相关的WB，发现了P53在MAM2存在下泛素化明显升高，在过表达circ时，p53的泛素化受到了抑制，在敲除circ时，p53泛素化增强，因此，作者认为是MDM促进了p53泛素化降解。

作者在补充材料里说了circ发挥稳定p53的功能是并非通过结合miR，而是以一种独特的方式存在，作者结合做了p53与circ直接结合的实验，通过构建不同蛋白肽段的蛋白与circ做RIP，发现DBD是circ直接结合的部位，因为MDM2是已知的泛素化E3的连接酶，所以，作者应用蛋白酶抑制剂，抑制p53降解，发现p53以circ浓度依赖的方式增加，并且减少了MDM的下拉，说明了p53与circ结合竞争了MDM与P53结合。（这幸亏是作者拉下了减少，要不然，这都说不清楚）

然后，作者又再次验证了circ与p53结合的肽段是否也是MDM结合的位点，惊奇的发现，他们重合。

紧接着，细胞内验证了这个circ的功能，一直这个circ明显促进了肿瘤的增殖，减少了静止期的肿瘤比例，降低了肿瘤凋亡的比例。

做了一波寂寞的动物，发现在体内有抑制肿瘤的作用。

一般来说，做到这里应该结束了，作者估计自己这么做都觉得没什么意思，没说明白问题，所以，看看没有P53时是不是也能发挥功能，所以，就敲了P53，但是，发现敲掉p53以后并没有发挥肿瘤抑制作用（这个p53在肿瘤中本来就是发挥抑制肿瘤的作用，你敲掉以后，如何说明circ没有通过p53发挥作用，那p53下游靶点的作用怎么排除，为什么不是突变了p53的结合位点，或者修饰p53的结合位点）

做了一波寂寞的流式细胞，但是，说明的是同一个问题。

最后探讨了这个东西在DNA损伤中的作用。（为什么做这个，我愣了，肿瘤拿来做DNA损伤修复，你开玩笑嘛？）发现这个东西可以修复肿瘤DNA损伤。（我巴不得肿瘤自己DNA损伤后去死，本来肿瘤中这个是低表达，最后，给人的结果是这个东西高表达反而对肿瘤有利，我他妈不知道到底是低表达好还是高表达好，这种结果解释不清，并且和作者前面的内容毫不相干，不知道为什么要做这方面的内容。）

好吧，文章分享结束，虽然是我母校的文章，但是，我已无力吐槽，欢迎批评、指正。